細菌16S rRNA基因全長約1,550個堿基對，由8個高度保守區(qū)和9個高變區(qū)(這些區(qū)域命名為V1至V9；圖1)組成。在進行16S rRNA基因測序研究時，二代測序由于讀長限制，往往使用通用引物擴增一個或幾個高變區(qū)，而PacBio全長16S測序能夠一次獲得V1-V9區(qū)9個高變區(qū)序列，從而個獲得更多信息，在種水平注釋具有重要優(yōu)勢。尤其中在醫(yī)學領域，全長16S rRNA基因測序已得到廣泛運用，其中包括人腸道菌群研究、皮膚、鼻腔、母乳、癌組織、宮腔、口腔等。

圖1.16S rRNA基因保守區(qū)和可變區(qū)的示例圖。

今天給大家分享3篇全長微生物多樣性的研究案例，快來看看吧！

案例一

標題：High-Level Acquisition of Maternal Oral Bacteria in Formula-Fed?Infant Oral Microbiota

譯名：配方奶喂養(yǎng)的嬰兒口腔微生物群中母體口腔細菌的高水平獲取[1]

期刊：mBio?[IF:7.867]

發(fā)表時間：2022年1月

研究方法：全長16S rDNA測序

文章簡介

背景：母體口腔微生物的大量涌入被認為在嬰兒口腔微生物群的獲得和發(fā)育中起著重要作用。

方法：研究者收集了448對母嬰在4個月體檢時的舌拭子樣本，運用PacBio的16S rRNA全長基因單分子測序和擴增序列變異(ASV)方法研究每個樣本的細菌組成。

結果：盡管嬰兒口腔微生物區(qū)系與母親口腔微生物群明顯不同，但與其親生母親共享的ASV的相對豐度中位數顯著高于與非親緣母親共享的ASV。這種共享豐度與嬰兒的喂養(yǎng)方式密切相關，而不是他們的分娩方式或抗生素暴露，配方奶喂養(yǎng)的嬰兒比純母乳喂養(yǎng)的嬰兒共享豐度更高。該研究提供了口腔細菌母嬰傳播的菌株水平證據，并表明在配方奶喂養(yǎng)的嬰兒中，母親口腔細菌的定殖率更高。

結論：通過全長16S rRNA基因測序和ASV序列分析的方法觀察到母體口腔微生物群向嬰兒的傳播，配方奶喂養(yǎng)的嬰兒獲得母體口腔細菌的數量明顯較高。此外，區(qū)分嬰兒細菌的來源使嬰兒口腔微生物群的細菌組成評估具有更高的分辨率。這種新的信息和方法可以為進一步研究口腔微生物群的發(fā)展奠定基礎，并最終可為建立新的預防和治療策略提供數據，運用于控制口腔微生物群的細菌平衡和致病性。

(A)?基于BrayCurtis距離的母親和嬰兒樣本的PCoA圖。(B)優(yōu)勢OTU的平均相對豐度和共享指數。(C)母嬰配對(n=448)和無關母嬰配對(n=198,464)的Bray-Curtis距離的小提琴曲線圖。(D)每名嬰兒與親生母親(n=448)和與無親緣關系的母親(n=198,464)分享的ASV總相對豐度的小提琴曲線圖。(E，F)與Veillonella dispar和?Streptococcus salivarius相對應的ASV的分布。

案例二

標題：Jia Wei Xiao Yao San ameliorates chronic stress-induced depression-like behaviors in mice by regulating the gut microbiome and brain metabolome in relation to purine metabolism

譯名：加味逍遙散通過調節(jié)與嘌呤代謝有關的腸道微生物組和腦代謝組改善慢性應激誘導的抑郁樣行為[2]

期刊：Phytomedicine??[IF: 5.340]

發(fā)表時間：2022年1月

研究方法：全長16S rDNA測序、非靶向代謝組學、行為測試、免疫熒光染色、細胞因子的定量等

文章簡介

背景：抑郁癥的發(fā)病機制很大程度上仍不清楚。越來越多的證據表明，腸道微生物群組成和腦功能之間存在著復雜的關系。加味逍遙散(JWXYS)被認為是一種潛在的抗抑郁藥物，但其藥理作用機制尚未闡明。該文章探討了加味逍遙散散對慢性應激誘導的小鼠抑郁行為的影響。

方法：建立慢性束縛應激抑郁小鼠模型。給予加味消炎散，通過多項行為學測試評價小鼠對治療的反應。用特異性熒光標記法檢測星形膠質細胞和小膠質細胞的活性；對腸道和腦組織中的炎性細胞因子進行定量。采用全長16S rRNA測序和非靶向代謝組學相結合的方法，從物種水平上研究腸道微生物群、代謝腦功能和JWXYS之間的關系。

結果：發(fā)現行為癥狀與動物乳桿菌(?L. animalis)的相對豐度有關。經JWXYS處理后，描述了具有潛在參與嘌呤代謝的酶的Ileibacterium valens菌的相對豐度。星形膠質細胞和小膠質細胞的激活與動物乳桿菌的相對豐度呈負相關。結合網絡藥理學分析，在加味消炎散治療的基礎上預測的幾個靶點集中在嘌呤代謝上，嘌呤代謝也富含JWXYS調節(jié)的腦代謝物。

結論：動物乳桿菌參與了小鼠的抑郁樣行為，加味消炎散可增加大腦嘌呤代謝相關酶的活性，并與杏仁核星形膠質細胞的激活呈正相關。

圖3.(A)不同群體的阿爾法多樣性指數(Chao1、PD_Whole_Tree.、Shannon、Simpson)的變化。(B)不同組樣本的beta多樣性指數(Bray-Curtis，未加權UniFrac)的特征。(C)基于對照組、模型組和JWXYM組之間的Lefse分析，確定腸道微生物組的潛在生物標志物。

案例三

標題：Evaluations and comparisons of microbial diversities in four types of?body fluids based on two 16S rRNA gene sequencing methods

譯名：基于兩種16S rRNA基因測序方法對四種體液微生物多樣性的評價與比較[3]

期刊：Forensic Science International ?[IF: 2.395]

發(fā)表時間：2021年11月

研究方法：全長16S rDNA測序、二代16S rDNA測序

文章簡介

背景：體液是犯罪現場常見的生物痕跡之一。了解這些生物痕跡的類型可以為法醫(yī)案件的調查提供關鍵線索。近年來，16S rRNA基因部分高變區(qū)測序和全長16S rRNA基因測序引起了研究人員的興趣，

方法：采用二代16S rRNA基因V3-V4短讀長測序和基于單分子實時測序的16S rRNA基因全長測序，對唾液、外周血、陰道分泌物和月經血中的微生物進行分類。

結果：短讀長測序的α多樣性指數大于全長測序。兩個平臺采集的4種體液中細菌類群水平相似，但豐度不同。主坐標分析和分子方差分析結果表明，陰道分泌物和經血的微生物組成相似，唾液、外周血、陰道分泌物和經血的微生物組成有顯著差異。線性判別分析表明，四種體液中篩選出的差異細菌在兩種測序結果中存在差異。兩種測序方法均可用于檢測4種不同體液中的細菌多樣性，為微生物鑒定4種體液提供了潛在的工具，其中全長測序能提供更準確的分類。

圖4.屬水平上四種體液細菌豐度柱狀圖。

全長微生物多樣性研究現狀

根據PubMed檢索結果，我們可以看到運用全長微生物多樣性發(fā)表的文章逐年遞增。一方面隨著測序技術也越來越成熟；另一方面PacBio sequel II通量的提升使得研究成本大幅降低，全球越來越多的研究學者開始采用全長微生物多樣性測序來進行微生物組學研究。

全長微生物多樣性優(yōu)勢一：數據準確性高

PB全長多樣性測序基于HIFI模式對單一片段進行多輪測序的方式來提升準確性。由于PacBio的原始錯誤為隨機錯誤，可通過獲取CCS（Circular Consensus Sequencing）進行自身糾正來提升數據的準確性。

 

細菌16S全長約1.5Kb，目前PacBio Sequel II測序平臺平均酶讀長可以達到70 Kb，當測序酶讀長達到?8Kb時，就可以滿足一條1.5Kb的16S全長糾錯5次，同一片段測序?5?次后，單一Read的準確性至少達到Q20（99%）

全長微生物多樣性優(yōu)勢二：種水平注釋率高

運用三代測序，可以輕松跨越V1-V9區(qū)，進而獲得全長序列，序列中攜帶的特征信息更多，可以支持“種”水平的分辨率，在文章撰寫中可在種水平進行深入挖掘和討論，尤其是在biomarker的尋找。常規(guī)樣本平均種水平注釋率可達60%。

全長微生物多樣性優(yōu)勢三：群落結構更準

不同物種不同高變區(qū)的變異程度不同，部分高變區(qū)研究可能嚴重低估或者高估群落中微生物的多樣性，不同高變區(qū)短讀長擴增子的PCR引物選擇會影響推斷的群落準確性和某些細菌類群的敏感性，使得微生物組研究很難在全局水平上進行比較；全長微生物多樣性一次獲得全部保守區(qū)和高變區(qū)序列，能夠精準還原微生物群落結構。

橫軸表示物種，縱軸表示豐度，黑色柱子表示全長16S鑒定準確而V4區(qū)測序失真；白色柱子表示V4區(qū)鑒定準確而全長16S結果失真，對比可以看出，全長16S的覆蓋度和準確度更高。E Singer et al.?ISME J

 

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