背景介紹

棗葉以其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值而聞名。然而，目前對(duì)棗葉中存在的代謝物缺乏全面和動(dòng)態(tài)的評(píng)估。根據(jù)棗果和棗葉的著色模式可將其分為兩類，I型包括大多數(shù)品種，其特點(diǎn)是果實(shí)顏色從綠色變?yōu)辄S色，然后變?yōu)榧t色，葉片顏色從淺綠色變?yōu)樯罹G色。II型包括一些觀賞品種，棗樹果實(shí)從紫色變?yōu)辄S色，然后變?yōu)榧t色，葉子顏色從紫色變?yōu)樯罹G色。研究表明葉綠素含量在果實(shí)發(fā)育早期達(dá)到峰值，并隨著果實(shí)成熟而降低?；ㄇ嗨貨Q定成熟期棗果的顏色，至今為止已從棗皮中鑒定出15種花青素，其中三種花青素隨著果實(shí)成熟過程而增加，有兩種轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)花青素的積累。目前，大多數(shù)研究都集中在果實(shí)顏色的色素成分和遺傳基礎(chǔ)上，而有關(guān)葉片顏色的信息卻少得多。該研究總結(jié)了兩個(gè)紫葉棗品種的葉芽和成熟葉的代謝和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。此外，還測(cè)定了相關(guān)基因的表達(dá)，并評(píng)估了光照對(duì)類黃酮積累的影響。作者闡明了棗葉顏色變化的代謝產(chǎn)物動(dòng)態(tài)變化和分子調(diào)控機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：本研究使用了兩個(gè)紫葉棗品種和八個(gè)綠葉棗品種。轉(zhuǎn)錄組和代謝組材料：兩個(gè)紫葉棗品種，“Sanbianhong”和“Tailihong”，?葉芽分別命名為L(zhǎng)S1和LT1，成熟葉分別命名為L(zhǎng)S2和LT2（圖1）

實(shí)驗(yàn)方法：對(duì)于光處理的植物，葉芽在萌發(fā)后暴露在自然光下。對(duì)于暗處理的植物，葉芽被黑色袋子覆蓋，并在5d后移除。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)：Illumina?HiSeq?X?Ten；代謝組用UPLC-MS/MS。

結(jié)果與分析

1、基于UPLC-MS/MS的棗葉定量代謝組學(xué)分析

根據(jù)聚類和相關(guān)性分析，12個(gè)樣本被明確分為四組（圖2A）。PCA主成分在LS1、LS2、LT1和LT2之間也表現(xiàn)出明顯的分離（圖2B）。圖2C所示，共鑒定出778種代謝物，可分為18類，但大多數(shù)代謝物可分為六類，包括類黃酮（23.14%）、有機(jī)酸和衍生物（14.52%）、氨基酸和衍生物（11.70%）、脂類（8.35%）、苯丙烷類（8.23%），核苷酸及其衍生物（6.68%）。黃酮類化合物顯然是主要的代謝產(chǎn)物，其可進(jìn)一步分為79種黃酮類化合物、40種黃酮醇、17種黃酮類化合物、12種花青素、7種異黃酮、3種原花青素和22種其他黃酮類化合物。在這些代謝物中，分別從LS1、LS2、LT1和LT2中檢測(cè)到732、690、729和708種代謝物（圖2D）?？偟膩碚f，結(jié)果表明了葉芽和成熟葉具有不同的代謝產(chǎn)物譜。

2、葉芽與成熟葉片的代謝組學(xué)變化

在LS1和LS2之間中共檢測(cè)到313?DAMs，LS1中有205個(gè)代謝物上調(diào)和108個(gè)代謝物下調(diào)（圖3A）。在LT1和LT2之間確定的316個(gè)DAMs中，211和105個(gè)代謝產(chǎn)物在LT1中分別上調(diào)和下調(diào)（圖3B）。LS2?vs.?LS1?中的DAMs可分為14類以上，大多數(shù)DAMs可分為五類，包括類黃酮（25.56%）、有機(jī)酸和衍生物（13.74%）、氨基酸和衍生物（12.46%）、苯丙烷類（7.99%）以及核苷酸和衍生物（7.03%）。這些黃酮類化合物可進(jìn)一步分類為37種黃酮類化合物、19種黃酮醇、9種黃酮類化合物、3種異黃酮類化合物、2種花青素、1種原花青素和9種其他黃酮類化合物。同樣，?LT2?vs.?LT1組中的DAMs也可以分為類似的類別，類黃酮（26.27%）、有機(jī)酸及其衍生物（12.03%）、氨基酸及其衍生物（11.08%）、苯丙烷類（9.81%）、脂類（9.49%）、核苷酸及其衍生物（8.54%）占很大比例。83種黃酮類化合物包括40種黃酮類化合物、18種黃酮醇、9種黃酮類化合物、7種花青素、1種原花青素、1種異黃酮和7種其他黃酮類化合物。多重比較分析表明，在“Sanbianhong”和“Tailihong”中都檢測(cè)到超過一半的DAMs（194種代謝物）（圖3C）。

DAMs也可大致分為兩組，第一組DAMs由抗氧化成分組成，包括類黃酮、生物堿、萜烯、維生素和衍生物、酚酰胺、多酚和甾體。大多數(shù)抗氧化成分在葉芽中的濃度高于成熟葉片中的濃度。第二組是味覺成分，包括有機(jī)酸和衍生物、氨基酸和衍生物以及碳水化合物。葉芽中的主要氨基酸和衍生物以及碳水化合物含量顯著高于成熟葉片。相反，有機(jī)酸及其衍生物的含量在“Sanbianhong”和“Tailihong”之間沒有表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)。綜上所述，我們的結(jié)果表明，“Sanbianhong”和“Tailihong”表現(xiàn)出相似的代謝物積累模式。在棗葉發(fā)育過程中，約40%的代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著差異，黃酮類化合物是主要的差異代謝產(chǎn)物。

3、葉片顏色變化背后的色素積累

為了闡明葉片顏色變化的色素生物合成機(jī)制，測(cè)定了兩個(gè)紫葉品種（“Sanbianhong”和“Tailihong”）和一個(gè)綠葉品種的色素含量。紫葉和綠葉品種的葉綠素和類胡蘿卜素含量表現(xiàn)出相似的積累模式，隨著葉片發(fā)育而急劇增加（圖4A和B）?！癝anbianhong”和“Tailihong”的花色苷含量在成熟過程中顯著降低。相反，“Fengmiguan”的花青素含量顯著增加（圖4C）。因此，結(jié)果表明，葉片顏色變化主要由花青素決定。

為了進(jìn)一步檢測(cè)花青素的類型，將花青素與代謝物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。其中兩種花青素，即花青素O-丁香酸和芹菜苷氯化物，在葉芽中表現(xiàn)出較高的含量，其他花青素在葉片發(fā)育期間保持在穩(wěn)定水平（圖4D）。從“Tailihong”的葉片中鑒定出11種花青素。其中三種花青素，即芹菜苷氯化物、花青素和花青素O-丁香酸隨著成熟過程而減少。相反，四種花青素，即飛燕草素3-O-葡萄糖苷、天竺葵素、牡丹素和矮牽牛素3-O-葡萄糖苷，隨著葉片發(fā)育而增加（圖4D）。多重比較表明，氰基鄰丁香酸和芹菜素氯化物在兩個(gè)紫葉品種的葉芽著色中起著關(guān)鍵作用（圖4E）

4、類黃酮結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因的差異表達(dá)

為了研究葉芽和成熟葉片之間的基因表達(dá)譜，從LS1、LS2、LT1和LT2制備了四個(gè)cDNA文庫。在LS1和LS2之間共檢測(cè)到9534個(gè)DEG，LS1中有5181個(gè)基因上調(diào)和4353個(gè)基因下調(diào)。與LT2相比，LT1中有3645個(gè)基因上調(diào)，2516個(gè)基因下調(diào)。

根據(jù)代謝組學(xué)分析結(jié)果，黃酮類化合物是棗葉中的主要代謝產(chǎn)物，并決定了棗葉的顏色。在“Sanbianhong”中，在LS1和LS2之間檢測(cè)到20個(gè)差異表達(dá)的類黃酮結(jié)構(gòu)基因，并且所有基因都隨著葉片發(fā)育而減少（圖5）。同樣，在成熟過程中，“Tailihong”中19個(gè)類黃酮結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大幅下降（圖5）。此外，“Sanbianhong”中差異表達(dá)的類黃酮結(jié)構(gòu)基因大部分與“Tailihong”中的DEGs重疊，包括一個(gè)C4H基因、兩個(gè)CHS基因、一個(gè)CHI基因、一個(gè)F3H基因、一個(gè)F3′H基因、一個(gè)F3′5′H基因、一個(gè)FLS基因、兩個(gè)DFR基因、兩個(gè)LAR基因、四個(gè)ANS基因和一個(gè)UFGT基因。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD40重復(fù)蛋白在調(diào)節(jié)類黃酮生物合成中發(fā)揮重要作用。在LS1和LS2之間共檢測(cè)到170個(gè)差異表達(dá)的類黃酮調(diào)節(jié)基因。LS1中有95個(gè)基因上調(diào)，包括52個(gè)R2R3-MYB基因、25個(gè)bHLH基因和18個(gè)WD40基因。

LS1中有75個(gè)基因下調(diào)，包括49個(gè)R2R3-MYB基因、12個(gè)bHLH基因和14個(gè)WD40基因。在LT1和LT2之間檢測(cè)到37個(gè)差異表達(dá)的類黃酮調(diào)節(jié)基因。27個(gè)基因上調(diào)，包括6個(gè)R2R3-MYB基因、21個(gè)bHLH基因和4個(gè)WD40基因；然而，只有兩個(gè)R2R3-MYB基因、3個(gè)bHLH基因和1個(gè)WD40基因在LT1中下調(diào)。27個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因在兩個(gè)品種之間重疊，包括7個(gè)R2R3-MYB基因、21個(gè)bHLH基因和4個(gè)WD40基因。

5、光照對(duì)葉芽黃酮積累的影響

光照是影響類黃酮積累的重要因素。為了研究光照對(duì)紅棗葉片中黃酮類化合物積累的影響，在光照和暗照條件下分別培育了‘Sanbianhong’和‘Tailihong’的葉芽。黑暗條件下的葉芽呈綠色（圖6A）。與光照處理的葉芽相比，黑暗處理的葉芽中總黃酮和總花青素的含量顯著降低（圖6B和C）。我們通過qRT-PCR分析進(jìn)一步研究了主要類黃酮結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與光照處理的葉芽相比，黑暗處理的葉芽中的大多數(shù)基因顯著下調(diào)（圖6D-M）。綜上所述，這些結(jié)果表明棗葉中的黃酮類化合物以光依賴的方式積累。

圖6暗處理?xiàng)l件（LS1-D和LT1-D）和光處理?xiàng)l件（LS1-L和LT1-L）下葉芽中類黃酮的積累。

結(jié)論

本研究從棗葉中鑒定出778種初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物。大約40%的代謝產(chǎn)物在葉芽和成熟葉之間存在顯著差異。這些可以DAMs大致分為兩組，包括抗氧化成分和味覺成分。黃酮類化合物是主要的DAMs，花青素決定了葉片的顏色，并以光依賴的方式積累。此外，通過RNA-Seq和qRT-PCR進(jìn)一步分析黃酮類化合物的生物合成。總之，我們的研究結(jié)果提高了人們對(duì)棗葉化學(xué)成分和藥用價(jià)值的認(rèn)識(shí)，為棗葉作為功能性食品的開發(fā)提供了理論支持。

 

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