什么是“人—三代重測(cè)序”？

“人—三代重測(cè)序”是指基于三代測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行人全基因組測(cè)序，利用獲得的10kb~20kb長(zhǎng)reads與人參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析，可以精準(zhǔn)開發(fā)得到樣品與參考基因組或者樣品間的DNA序列的遺傳變異，如結(jié)構(gòu)變異（Structural Variation，SV）和拷貝數(shù)變異（copy number variations, CNV）等，而這些大片段的序列變異的檢測(cè)是二代重測(cè)序無法做到的。

為什么要做“人—三代重測(cè)序”？

利用開發(fā)得到SV、CNV可以應(yīng)用到個(gè)體或群體間的差異性分析、疾病或癌癥領(lǐng)域的HLA、STR等研究中。三代重測(cè)序以其長(zhǎng)讀長(zhǎng)（可直接跨越大片段結(jié)構(gòu)變異；可直接跨越串聯(lián)重復(fù)區(qū)域、高GC區(qū)域、高度同源區(qū)域、高度多態(tài)性區(qū)域）、無需PCR擴(kuò)增（避免PCR擴(kuò)增引入的錯(cuò)誤）等優(yōu)勢(shì)，成為挖掘人基因組遺傳變異信息的全新策略。

“人—三代重測(cè)序”信息分析流程

采用Nanopore測(cè)序，將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并過濾得到Clean?Reads，用于后續(xù)的生物信息學(xué)的分析。生物信息分析流程圖如下：

部分分析結(jié)果展示

1、數(shù)據(jù)質(zhì)控

Nanopore測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后，將其數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為fastq格式，用于后續(xù)質(zhì)控分析。原始fastq數(shù)據(jù)經(jīng)進(jìn)一步過濾接頭、過濾短片段、過濾低質(zhì)量reads后，得到總的數(shù)據(jù)集。

2、變異檢測(cè)

基因組結(jié)構(gòu)變異，SVs，通常指的是長(zhǎng)度大于50bp的大片段結(jié)構(gòu)變異，包括許多類型，如缺失（DEL）、插入（INS）、重復(fù)（DUP）、倒位（INV）、拷貝數(shù)變異（CNV）等，它們?cè)趥€(gè)體和群體水平上促進(jìn)了人類基因組的多樣性和進(jìn)化。相比SNP，SVs在變異基數(shù)中所占比例更多，對(duì)基因組的影響更大，一旦發(fā)生變化，往往會(huì)給生命體帶來重大影響。越來越多的證據(jù)表明，SVs與許多人類疾病有關(guān)，如神經(jīng)發(fā)育疾病、心血管疾病和癌癥等。因此，系統(tǒng)地分析人類基因組中的 SVs 對(duì)于生物學(xué)和臨床研究至關(guān)重要。

本次分析采用長(zhǎng)讀長(zhǎng)納米孔測(cè)序，更有可能涵蓋整個(gè)結(jié)構(gòu)變異體和/或重復(fù)區(qū)域，從而獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)變異體，加深對(duì)結(jié)構(gòu)變異以及結(jié)構(gòu)變異在疾病、進(jìn)化和遺傳多樣性的作用的理解。

3、重復(fù)序列分析

微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite），又被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats, STRs）或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats, SSRs），是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段（核心序列）串聯(lián)重復(fù)組成，其重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富。目前已發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列和40多種神經(jīng)肌肉和神經(jīng)退行性疾病等疾病有關(guān)，包括眾所熟知的精神發(fā)育遲滯疾病—脆性X染色體、神經(jīng)退行性疾病—亨廷頓舞蹈癥、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)癥等，此外微衛(wèi)星不穩(wěn)定性MSI也是許多癌癥基因組特征。由于重復(fù)序列的擴(kuò)張引起的疾病稱為重復(fù)序列擴(kuò)張疾病，當(dāng)然有些重復(fù)序列縮短也能引起疾病。其發(fā)病機(jī)制與這些重復(fù)的微衛(wèi)星序列的重復(fù)次數(shù)相關(guān)。利用三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)，可用來檢測(cè)衛(wèi)星序列重復(fù)次數(shù)。

4、HLA分型

主要組織相容性復(fù)合體MHC區(qū)域位于6號(hào)染色體的短臂上，是人類基因組上*復(fù)雜的區(qū)域之一（約4Mb），呈現(xiàn)出高度的多態(tài)性（有著超過10,000個(gè)等位）。其編碼的分子參與抗原遞呈，制約細(xì)胞間相互識(shí)別及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。人類白細(xì)胞抗原（HLA）編碼基因是 MHC 的一部分，是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性*高的基因復(fù)合體，也是不同個(gè)體進(jìn)行器官或組織細(xì)胞移植時(shí)發(fā)生排斥的主要成分。

與 HLA 相關(guān)的疾病多達(dá)100多種，涉及自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、過敏性疾病、感染類疾病、代謝性疾病等，如糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病、強(qiáng)直性脊柱炎、重癥肌無力和哮喘等。同時(shí)，HLA在器官和骨髓等移植中起到至關(guān)重要的作用，也與許多藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng)相關(guān)。因此，進(jìn)行HLA 分型，有利于免疫相關(guān)疾病的研究、疫苗和藥物靶向人群篩選、種族進(jìn)化的研究、組織和器官移植等。

本次分析對(duì)樣品的 HLA-A，HLA-B，HLA-C 基因進(jìn)行單倍型鑒定。將測(cè)序的Nanopore?reads與已知的HLA等位比對(duì)來識(shí)別候選的等位，接下來通過與候選等位的多重比對(duì)獲取一致序列，最后通過將一致序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲取每個(gè)樣品最終的單倍型。

總結(jié)

（1）通過三代重測(cè)序?qū)θ嘶蚪M進(jìn)行SV、CNV等變異檢測(cè)，系統(tǒng)分析人全基因組的結(jié)構(gòu)變異。

（2）三代測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)長(zhǎng)，可輕松跨越基因組低復(fù)雜度區(qū)域，且無GC偏好性，利用三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)，更有利于檢測(cè)STRs。

（3）二代測(cè)序技術(shù)受讀長(zhǎng)的限制，會(huì)導(dǎo)致 HLA 分型數(shù)據(jù)不明確，三代測(cè)序憑借其長(zhǎng)讀長(zhǎng)特點(diǎn)，能夠顯著提高HLA分型的準(zhǔn)確性。

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