少量樣本，實驗只做qPCR驗證，如何發(fā)表8+文章？

今天跟大家分享一篇少量樣本結(jié)合多組學數(shù)據(jù)聯(lián)合分析的研究報道，“彌漫性甲狀腺腫和橋本甲狀腺炎微環(huán)境中免疫細胞基因表達失調(diào)和代謝信號異常的全局調(diào)控網(wǎng)絡”，該文是百邁客合作客戶青島大學醫(yī)學院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院宋西成教授團隊發(fā)表在Frontiers?in?Immunology（IF=8.786）的研究成果，發(fā)表時間為2022年5月。百邁客為該研究提供了單細胞轉(zhuǎn)錄組、全轉(zhuǎn)錄組、全長轉(zhuǎn)錄組和代謝組的建庫測序服務。

研究背景

人類自身免疫性甲狀腺疾病?(AITD)?是最常見的器官特異性自身免疫性疾病，也是甲狀腺功能障礙和非地方性甲狀腺腫的最常見原因，主要表現(xiàn)為彌漫性甲狀腺腫（Graves’disease，GD）和橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s?thyroiditis，HT）；HT和GD具有不同的臨床特征，但它們在組織損傷方面是相似的，包括體內(nèi)淋巴細胞浸潤。研究表明，T淋巴細胞及其特異性細胞因子作為免疫不可或缺的組成部分，在AITD的發(fā)生中起關鍵作用，例如調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)和輔助T細胞17?(Th17)的失調(diào)、Th1/Th2失衡在AITD的發(fā)病機制中起著關鍵作用，但這些細胞亞群免疫功能障礙引起的致病分子機制在很大程度上仍未得到解釋。

本研究基于HT患者、GD患者和健康對照甲狀腺組織的單細胞RNA測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組測序數(shù)據(jù)，探討了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達失調(diào)和代謝信號異常的免疫細胞，構(gòu)建了免疫細胞的全局調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，為進一步了解HT和GD免疫紊亂和代謝異常介導的疾病機制、更好地干預和治療疾病提供了科學的理論指導和研究基礎。

研究思路

主要內(nèi)容

1、全轉(zhuǎn)錄組測序分析HT和GD的異常表達基因

為了鑒定HT組和GD組中異常表達的lncRNA和miRNA，分別進行了ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序和全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。差異表達分析結(jié)果顯示，共檢測到6,153?個?lncRNA?s和?741?個?miRNAs?在?HT?患者中存在差異表達（圖?1A）；GD患者中檢測到5,492個lncRNAs?和?165?個?miRNAs?存在差異表達（圖?1B）；相關性分析結(jié)果驗證了本研究中兩種測序方法的檢測穩(wěn)定性（圖?1C,?D）。

2、HT和GD基因表達差異與異常免疫級聯(lián)和代謝信號傳導有關

對HT組和GD組顯著差異基因進行功能富集分析，結(jié)果顯示，HT組中顯著富集的通路為白細胞-細胞粘附、T?細胞活化和分化、細胞因子代謝過程和免疫反應激活的信號轉(zhuǎn)導（圖?2A），而GD組中，則顯著富集的信號通路為白細胞-細胞粘附、激素代謝過程和的細胞趨化性（圖?2B）；此外，HT（圖?2C）和GD（圖?2D）均富含與甲狀腺疾病相關的信號通路，包括甲狀旁腺激素合成、甲狀腺激素分泌、甲狀腺激素信號通路作用和自身免疫性甲狀腺疾??；同時，HT和GD還富集了其他幾種免疫炎癥和代謝信號相關通路，包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、Th1和Th2細胞分化、NF-kappa?B信號通路、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝和酪氨酸代謝。

為了進一步確定代謝物在HT和GD中的作用，對HT組、GD組及對照組的代謝組數(shù)據(jù)進行差異代謝物分析及代謝通路富集分析（圖?2E,?F）。結(jié)果顯示，相較于對照組，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝和類固醇生物合成的代謝通路在HT組中顯著激活（圖?2G(a)），而亞油酸代謝和類固醇激素生物合成代謝通路受到抑制（圖?2G(b)）；此外，類固醇激素生物合成、咖啡因代謝和花生四烯酸代謝通路在GD組中被激活（圖?2G(c)），而苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及亞油酸代謝通路受到抑制（圖?2G(d)）。

鑒于免疫反應在HT和GD中的重要作用，利用GSEA方法進行免疫浸潤分析，進一步評估了樣本中免疫細胞的豐度，發(fā)現(xiàn)CD4?+T細胞、CD8?+?T細胞、巨噬細胞、Th1和Th2細胞均有不同程度的浸潤（圖?2H）。

3、HT和GD中疾病微環(huán)境中CD4+?T細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常

對單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD4+?T細胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對照組中細胞豐度存在明顯差異（圖?3A）。將bulk?RNA-seq數(shù)據(jù)中顯著差異表達的基因，與CD4+??T細胞的單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)中的基因取交集，并對這些共表達的基因集進行功能富集分析；分析結(jié)果顯示，HT組中顯著差異富集的通路有甲狀腺激素信號通路、T?細胞受體信號通路、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、細胞因子-細胞因子受體相互作用和NF-kappa?B信號通路（圖?3B）；而在GD組中，甲狀旁腺激素合成，分泌和作用、ECM-受體相互作用、嘌呤代謝、cAMP?信號通路、NF-kappa?B?信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和T細胞受體信號通路顯著富集（圖?3C?)。GSEA富集分析結(jié)果顯示，HT組中細胞因子-細胞因子受體相互作用和T細胞受體信號通路顯著富集（圖?3D），但GD組中未觀察到顯著富集的通路。此外，氨基酸生物合成和嘌呤代謝相關的代謝通路在HT和GD組中均顯著富集。

4、HT和GD疾病微環(huán)境中CD8+?T細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常

對單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD8+??T細胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對照組中細胞豐度存在明顯差異（圖?4A）；與CD8+?T細胞亞群類似，將與bulk數(shù)據(jù)中共表達的基因集進行功能富集分析。結(jié)果顯示，在HT（圖?4B）和GD（圖?4C）中，顯著富集的通路有抗原加工和呈遞、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、細胞因子-細胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號通路；甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用及白細胞跨內(nèi)的遷移途徑在HT組顯著富集；而GD組中，嘌呤代謝和cAMP信號通路顯著富集。GSEA分析結(jié)果顯示，HT組中細胞因子-細胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號通路顯著富集（圖?4D），而在GD組中未發(fā)現(xiàn)顯著富集的通路；嘌呤代謝信號通路在HT組和GD組中均富集。

5、HT和GD微環(huán)境巨噬細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常

對單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD8+?T細胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)?HT、GD?和對照組中巨噬細胞豐度存在明顯差異（圖?5A）。同樣地，將與bulk數(shù)據(jù)共表達的基因集進行功能富集分析；分析結(jié)果顯示，HT組（圖?5B）和GD組（圖?5C）顯著富集的信號通路有甲狀旁腺激素的合成，分泌和作用、抗原加工和呈遞、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、NF-kappa?B信號通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用；T組中，甲狀腺激素信號通路和Toll樣受體信號通路顯著富集；GD組中，吞噬體、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑顯著富集。GSEA富集分析結(jié)果顯示，HT組中細胞因子-細胞因子受體相互作用、NF-kappa?B信號通路、Th1和Th2細胞分化以及Th17細胞分化通路顯著富集（圖?5D)，而GD組中沒有發(fā)現(xiàn)類似的富集通路；嘌呤和苯丙氨酸代謝信號通路分別在HT組和GD組中顯著富集。

 

6、HT和GD微環(huán)境中T細胞和巨噬細胞的調(diào)控網(wǎng)絡分析

為了確定HT和GD疾病微環(huán)境的細胞間調(diào)節(jié)機制，對CD4+?T細胞、CD8+?T細胞和巨噬細胞進行iTALK細胞通訊分析。分析結(jié)果顯示，HT（圖?6A）和GD（圖?6B）中配體-受體對的豐度存在顯著差異；HT組中，微環(huán)境中的T細胞主要通過IL16-CCR5、FGF10-FGFR1、CXCL13-CXCR3和CD70-CD27受體配體對靶向巨噬細胞，激活細胞因子-細胞因子受體相互作用和T細胞受體信號通路（圖?6C）；GD組中，微環(huán)境T細胞主要通過CXCR3-CXCL10、PKM-CD44和?CCL21-CCR7受體配體對靶向巨噬細胞，激活EMC受體相互作用和NF-kappa?B信號通路（圖?6D）；相較于對照相，調(diào)控網(wǎng)絡中的關鍵基因（CCL21、CCR7、CD4、CD27、CD70、CXCL13、ICOS、IL-16、LAT、TNF及IL16），經(jīng)qPCR實驗驗證，在HT組?(圖?6E?)?和GD?(圖?6F?)均顯示存在顯著差異表達。

 

研究小結(jié)

本研究利用轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平的測序數(shù)據(jù)聯(lián)合，在單細胞水平上鑒定了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達失調(diào)和代謝信號異常的免疫細胞；同時，構(gòu)建了免疫細胞的全局調(diào)控網(wǎng)絡，為HT和GD疾病機制介導的免疫失調(diào)和代謝異常提供了新的視角。

參考文獻

Zheng,?Haitao?et?al.?“A?Global?Regulatory?Network?for?Dysregulated?Gene?Expression?and?Abnormal?Metabolic?Signaling?in?Immune?Cells?in?the?Microenvironment?of?Graves’?Disease?and?Hashimoto’s?Thyroiditis.”?Frontiers?in?immunology?vol.?13?879824.?26?May.?2022,?doi:10.3389/fimmu.2022.879824