到目前為止，已經(jīng)在切除的腦組織中研究了癲癇腦中的基因表達變化，以評估所有類型的神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞以及非神經(jīng)細胞(血管、室管膜細胞等)的平均變化。盡管這些研究提供了一些關(guān)于基因表達大規(guī)模變化的重要信息，但僅發(fā)現(xiàn)了相對較小的轉(zhuǎn)錄組變化，即使與高度硬化組織相比也是如此。這可以很容易地通過批量測序的局限性來解釋，在所有細胞類型的組織樣本中平均基因表達，由于丟失特定細胞類型的信息，導致信號稀釋。因此，為了研究不同亞型的神經(jīng)元是如何在癲癇中受到影響的，需要通過單細胞水平精準鑒定癲癇病各亞型神經(jīng)元基因表達變化。由于新鮮腦組織樣本難以獲取、并且解離過程會有偏差無法得到全部的細胞類型，因此新的技術(shù)單核RNA測序(snRNA-seq)的出現(xiàn)極大的解決目前的困境，可以直接通過冷凍腦組織抽提細胞核進行單細胞水平研究。今天，小編為大家獻上近期發(fā)表在Nature Communication雜志上利用snRNA-seq研究顳葉癲癇癥（TLE）的應(yīng)用一文，值得大家了解更多snRNA-seq技術(shù)應(yīng)用，幫助大家完成更多冷凍樣本、珍稀樣品單細胞水平研究。

英文題目：Identifification of epilepsy-associated neuronal subtypes and gene expression underlying epileptogenesis

中文題目：鑒定癲癇相關(guān)的神經(jīng)元亞型和誘發(fā)癲癇的基因表達

發(fā)表時間：2020年10月7號

影響因子：12.121

研究背景

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有自發(fā)性和反復(fù)發(fā)作的特征，其主要發(fā)生在海馬體或大腦皮層區(qū)域。人們對癲癇的病理生理學仍然知之甚少。雖然有一些動物模型研究顯示某些神經(jīng)元亞型對癲癇發(fā)作的產(chǎn)生和傳播有一定的促進作用，但在人類癲癇患者的相應(yīng)數(shù)據(jù)卻很少。這是由于癲癇發(fā)生過程中復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)象。

實驗方法

10x snRNA-seq，Smart-seq2?snRNA-seq，RNA-seq，ISH等

結(jié)論

該項研究揭示了癲癇對神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄的不同影響—即雖然許多亞型表現(xiàn)出輕微的基因表達變化，但其對一些特定的SUB型主要神經(jīng)元和GABA能間神經(jīng)元產(chǎn)生了很大的影響。

結(jié)果

一、癲癇皮質(zhì)中與疾病相關(guān)的神經(jīng)元亞型

為了識別哪些神經(jīng)元亞型受癲癇影響或?qū)е掳d癇，文章中比較了來自癲癇性顳皮質(zhì)和非癲癇性顳皮質(zhì)的snRNASeq數(shù)據(jù)，研究結(jié)果表明，在一些位置，例如，皮層上層L2_Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3，在癲癇和非癲癇的皮層產(chǎn)生的神經(jīng)元之間存在明顯的轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)移(圖1a)。此外，盡管癲癇病和非癲癇病樣本中每個亞型的神經(jīng)元數(shù)量大致相似，但觀察到幾種亞型中已被鑒定的細胞核數(shù)量顯著減少(圖1b)。在癲癇患者中，L2/3亞型的數(shù)量減少了，當對每種情況下的序列神經(jīng)元總數(shù)進行歸一化時，這種減少更加明顯(圖1c)。對于中間神經(jīng)元，Pvalb_Sulf1亞型的神經(jīng)元數(shù)量減少較多(圖1c)。

通過基因表達相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)癲癇和非癲癇神經(jīng)亞型之間的巨大差異(圖1d)，這可能表明癲癇對其轉(zhuǎn)錄組有特定的影響。對于主要神經(jīng)元，L5-6_Fezf2_Tle4_Abo、L5-6_Themis_Ntng2、L2_
Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3亞型在癲癇和非癲癇皮質(zhì)中轉(zhuǎn)錄組差異大(圖1d)。對于gaba能間神經(jīng)元，在癲癇發(fā)作的顳葉皮層中，Vip_Cbln1、Sst_Tac1、Pvalb_Sulf1、Pvalb_Nos1和Id2_Lamp5_Nos1的轉(zhuǎn)錄組改變大。同時也證實了癲癇相關(guān)DE基因在具有較大轉(zhuǎn)錄組差異的神經(jīng)元亞型中普遍存在(圖1e、f)。

二、共有和亞型特異性癲癇相關(guān)途徑

作者計算了每種已鑒定亞型GO中DE基因的富集程度，一些神經(jīng)元亞型在癲癇中表現(xiàn)出了大的轉(zhuǎn)錄組改變(>100豐富的GO)，但多數(shù)神經(jīng)元亞型中只有少數(shù)GO，特別是對于生物過程(BP)來說，這應(yīng)該與通路的生物學功能相關(guān)(圖2a)。這些受影響較小的亞型中，大多數(shù)在癲癇細胞和非癲癇細胞之間也具有高的基因表達相關(guān)性(圖1d)，從而證實癲癇和非癲癇之間轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性高的亞型中，癲癇改變的信號通路也較少。

根據(jù)GO分析，發(fā)現(xiàn)一些Sst亞型、Vip_Cbln1和Id2_Lamp5亞型顯示DO高度富集，如局灶性癲癇(DOID:2234)、癲癇綜合征(DOID:1826)和顳葉癲癇(DOID:3328)。此外，還發(fā)在L3_Cux2_Prss12、L5-6_Fezf2_Lrrk1_Sema3e和L5-6_Fezf2_Tle4_Abo主要神經(jīng)元亞型中富集的與癲癇相關(guān)的DO相同。這表明，與癲癇相關(guān)的DO在不同的神經(jīng)元亞型中富集差異很大，與谷氨酰胺能細胞相比，在GABAergic和Sst亞型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中，癲癇相關(guān)的DO在GABAergic和Sst亞型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中富集更廣泛，顯示出對癲癇的特殊易感性。

三、癲癇活動的信號通路

谷氨酸受體，尤其是AMPA受體被證明是癲癇發(fā)作的主要驅(qū)動力之一，在篩選出缺乏表達的基因后，尋找富含與奮性相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學變化的亞型，并從這些GO項中繪制DE基因（圖3a–d）。CKAMP44是貫穿整個顳葉皮質(zhì)的主要AMPA受體輔助亞基，這一事實也強調(diào)了CKAMP44上調(diào)的重要性(圖3c, d)。癲癇對AMPA受體輔助亞基編碼基因的上調(diào)有相當普遍的影響。

多種谷氨酸受體亞基和神經(jīng)元活性相關(guān)基因表達復(fù)雜失調(diào)，其中大部分在癲癇中未見報道。因此,雖然大多數(shù)的基因編碼谷氨酸受體亞基表達上調(diào)(GRIA1、GRIA3 GRIA4, GRIK3, GRIK4, GRIK5, GRIN2B, GRIN3A, GRM1, GRM7,和GRM8),但一些是表達下調(diào)(GRIA2、GRIA3 GRIN2A, GRM5, GRIK1,和GRIK2)(圖3?b, c)。

癲癇患者皮層谷氨酸介導興奮相關(guān)基因顯著分層上調(diào)或下調(diào)。作者用單分子熒光原位雜交(smFISH)方法標記了幾個高度調(diào)控基因的mRNA。如上所述，在主要神經(jīng)元的亞型中，編碼AMPA輔助亞基的許多基因分層上調(diào)。因此，在一組癲癇和非癲癇樣本的皮質(zhì)切片中標記了CKAMP44 mRNA，通過與Rorb和DAPI共標記，并確定了L2/3、L4和L5/6的位置(圖4b)。重要的是，證實了各層中CKAMP44的表達顯著上調(diào)(圖4b)。

四、受癲癇影響的基因網(wǎng)絡(luò)

在癲癇樣本中，六個與癲癇密切相關(guān)的模塊上調(diào)，六個下調(diào)。另外，在細胞水平分析中突出的幾個涉及過度興奮信號和癲癇發(fā)作的基因也是一個或多個癲癇相關(guān)基因模塊的成員。編碼谷氨酸受體亞基的基因也廣泛存在于癲癇相關(guān)模塊中。這些基因共表達分析捕獲了主要神經(jīng)元L5-6_Fezf2_Tle4_Abo和L2-3_Cux2亞型中活躍的核心轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。與癲癇狀態(tài)相關(guān)的基因模塊指向與突觸和離子通道相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化，包括AMPA受體輔助亞基、谷氨酸受體亞基和電壓門控鈉通道，這些可能與癲癇回路異常高的興奮有關(guān)。同時觀察到主要神經(jīng)元和GABAergic間神經(jīng)元的受影響的亞型根據(jù)豐富的GO項的相似性聚集在一起(圖5b)。因此，L2-3_Cux2和L5-6_Fezf2亞型與Sst_Tac1和Vip_Cbln1亞型共聚，而L3_Cux2_Prss12亞型與Pvalb_Sulf1亞型共聚，這可能是癲癇轉(zhuǎn)錄組中受影響嚴重的局部神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)。

結(jié)論

總之，該研究通過單核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA-seq）發(fā)現(xiàn)癲癇患者的神經(jīng)轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了大規(guī)模而復(fù)雜的變化，其中一些亞型表現(xiàn)出了明顯的癲癇驅(qū)動的基因表達異常，而其他亞型則大部分未受影響。癲癇相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組改變可以聚集成包含多個神經(jīng)元亞型的模塊，這些神經(jīng)元亞型可能是受癲癇影響的不同神經(jīng)元聚集的基礎(chǔ)。未來需要在小鼠模型和人類組織中進行轉(zhuǎn)化研究，以解決哪些已確定的通路導致癲癇的產(chǎn)生和傳播，以及哪些更能代表神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)可塑性。

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