研究背景

抗凍性不僅決定著植物的地理分布，而且影響著作物、蔬菜和水果的產(chǎn)量，已成為溫帶和北溫帶地區(qū)人們關(guān)注的焦點(diǎn)。植物通過一個(gè)稱為“低溫馴化”的過程來增加它們的抗凍性，而通過“脫馴化”失去抗凍性。低溫馴化是一個(gè)多基因調(diào)控的過程，伴隨著植物的生理調(diào)節(jié)。多年生木本植物的低溫馴化通常包括兩個(gè)階段，分別由短光周期和低溫誘導(dǎo)。盡管多年生木本植物對(duì)光周期和低溫的表型反應(yīng)已經(jīng)被了解得很清楚，但在分子水平上知之甚少。

在這篇文章中，研究者選用多年生木本植物杜鵑花屬的常綠品種‘ElsieLee’進(jìn)行低溫馴化，其葉子在冬天變?yōu)榧t色，春天又變成綠色，這為花青素在低溫馴化中的重要作用提供了機(jī)會(huì)。本研究結(jié)果可全面認(rèn)識(shí)野外和人工低溫馴化的差異，為了解多年生木本植物越冬常綠葉片的低溫馴化奠定基礎(chǔ)。

研究方法

選3年生的“ElsieLee”杜鵑，用于田間或人工低溫馴化試驗(yàn)，共3組試驗(yàn)：ExperimentI田間低溫馴化（F-CA），ExperimentII人工低溫馴化（A-CA），ExperimentIII人工用紫外光B進(jìn)行低溫馴化（A-CA+UVB）。每組試驗(yàn)36盆，分為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)12盆，采集當(dāng)年生長的完全展開的葉子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，葉片在抽樣日期收集后立即在液氮中冷凍，然后-80℃保存。

研究結(jié)果

1、葉片耐凍性及花青素的積累

LT50為引起50%損傷的溫度，在試驗(yàn)I中，10月26日（該日期下的樣品視為未馴化的樣品）平均溫度約為22℃，光照11.2h，此時(shí)LT50為-4.3℃。試驗(yàn)II和III在人工低溫馴化前處在營養(yǎng)生長階段，溫度為25℃，光照16h，LT50為-4.2℃。

F-CA（10月26日-1月20日）期間，LFT隨溫度降低和光照減少而增強(qiáng)，1月20日，葉片組織獲得整個(gè)F-CA期最強(qiáng)的LFT（LT50為-18.5℃）。A-CA（4℃）或UVB（4℃+紫外光B）馴化56天后，LFT提高至-10℃。F-CA中，葉片花青素含量逐漸增加，但在A-CA中沒有明顯變化，而在UVB中，處理14天后，花青素開始增加，處理56天后，花青素的濃度約為1月20日F-CA處理時(shí)的一半。結(jié)合A-CA和UVB的LFT數(shù)據(jù)，花青素本身是否增強(qiáng)了LFT尚不清楚。

2、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、主要成分分析，以及在田間和人工低溫馴化過程中差異表達(dá)基因的鑒定

根據(jù)LFT和花青素的生理變化，選擇5個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，每個(gè)樣本三個(gè)生物學(xué)重復(fù)（圖1a）。

轉(zhuǎn)錄組共鑒定出94,144個(gè)unigenes，N50為1800。所有unigenes被用來進(jìn)行主成分分析（圖2a），結(jié)果顯示（i）每個(gè)樣本生物學(xué)重復(fù)功能上相似；（ii）主成分1（PC1）能將CA與非馴化分離，主成分2（PC2）能夠?qū)-CA與A-CA和A-CA+UVB分開；（iii）F-NA與A-NA的距離表明葉片在早秋與營養(yǎng)生長時(shí)的狀態(tài)是不同的。

三組試驗(yàn)F-NAvs.F-CA（I）、A-NAvs.A-CA（II）及A-NAvs.A-CA+UVB（III）分別注釋了3023、1235和2620個(gè)差異表達(dá)基因，其中438個(gè)為共同差異表達(dá)基因，另有2229、122和1259個(gè)上調(diào)或下調(diào)基因分別為試驗(yàn)I、II和III所特有的（圖2b）。

試驗(yàn)I、II和III富集的KEGG通路分別為23、26和31個(gè)（圖2c）。其中8個(gè)為試驗(yàn)I特有的，包括4個(gè)光合作用相關(guān)通路（KO00195、KO00196、KO00906和KO04146）及兩個(gè)脂肪酸代謝通路（KO00591和KO00592）。三組試驗(yàn)共有的通路為11個(gè)，包括5個(gè)碳水化合物通路（KO00040、KO00053、KO00500、KO00630和KO01200）、3個(gè)次級(jí)代謝通路（KO00904、KO00940和KO00941）、1個(gè)氨基酸代謝通路（KO00410）、1個(gè)脂質(zhì)代謝通路（KO00071）和1個(gè)晝夜節(jié)律通路（KO04712）（圖2c）。

3、在F-CA中的特異性富集的KEGG通路

KO00906為類胡蘿卜素生物合成途徑，在試驗(yàn)I中富集（圖2c），該途徑導(dǎo)致ABA的生物合成和分解代謝（圖3a）。該通路中，3個(gè)被注釋為β-胡蘿卜素3-羥化酶（CHY-β）表達(dá)量上調(diào)（圖3b）。CHY-β將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為玉米黃素，玉米黃素在非光化學(xué)猝滅的熱耗散中起關(guān)鍵作用。一個(gè)被注釋為玉米黃素環(huán)氧化酶（ZEP）的差異基因表達(dá)下調(diào)。在葉黃素循環(huán)中，ZEP將玉米黃素/環(huán)氧玉米黃素轉(zhuǎn)化為紫黃素。因此，在試驗(yàn)I中，玉米黃素的積累可能與CHY-βs上調(diào)及ZEP下調(diào)有關(guān)（圖3b）。

有趣的是，有5個(gè)注釋為ABA8-羥化酶（ABA8’ox），其中在F-NA中表達(dá)水平較低的ABA8’ox1-3在F-CA中表達(dá)上調(diào)，而ABA8’ox4-5在F-CA中受到抑制（圖3b），類胡蘿卜素是ABA的前體，而ABA是ABA8’ox的底物（圖3a）。ABA8’ox隨內(nèi)源ABA水平的增加而上調(diào)。試驗(yàn)I10月26日的ABA濃度是試驗(yàn)II和試驗(yàn)III0天處理的3倍左右(圖3c)，試驗(yàn)I1月20日的ABA水平下降到試驗(yàn)II和試驗(yàn)III0天處理的水平(圖3c)。因此，ABA8’ox1-3可能參與了F-CA過程中ABA的分解代謝，而ABA8’ox4-5可能在非馴化條件下受高水平ABA誘導(dǎo)(圖3c)。

試驗(yàn)I中，KO00591亞油酸代謝和KO00592α-亞麻酸代謝分別富集了7個(gè)和20個(gè)DEGs。這些途徑促進(jìn)JA的生物合成(圖4a)。5個(gè)編碼脂氧合酶(LOX)的DEGs同時(shí)存在于這兩個(gè)途徑中且表達(dá)下調(diào)。α-亞麻酸和亞油酸都是多不飽和脂肪酸(PUFAs)和LOX的底物。α-亞麻酸代謝途徑的20個(gè)DEGs中有7個(gè)是上調(diào)的。其中5個(gè)被注釋為12-氧代植二烯酸還原酶(12-OPR3)，轉(zhuǎn)錄水平很低。另一個(gè)注釋為12-OPR3的基因在F-NA中高表達(dá)，而在F-CA中表達(dá)下調(diào)(圖4b)。

試驗(yàn)I的茉莉酸含量在10月26日至1月20日期間大幅度下降了93%，試驗(yàn)II在0~56天期間下降了66%；而在試驗(yàn)III中，沒有明顯變化(圖4c)。AtLOX2和AtCYP74A(alleneoxidesynthase,AOS)已被證明是擬南芥JA生物合成的關(guān)鍵酶，其中任何一種的缺失都會(huì)抑制JA的生物合成。此外，NaLOX3參與了煙草中JA的積累。本研究中，13-LOXs和AOSs在試驗(yàn)I和II中均下調(diào)(圖4b)，表明抑制亞麻酸的消耗可能是為了在應(yīng)對(duì)低溫時(shí)保持膜的流動(dòng)性。UVB被證明可以誘導(dǎo)擬南芥中JA的生物合成。因此，低溫抑制JA生物合成，而UVB處理可能導(dǎo)致整個(gè)試驗(yàn)III中JA含量穩(wěn)定(圖4c)。

KO00195光合作用、KO00196光合作用-天線蛋白和KO04146過氧化物酶體通路在試驗(yàn)I中特異性富集(圖2c)，它們與光保護(hù)相關(guān)。在KO00196光合-天線蛋白通路中，DEGs被注釋為光捕獲復(fù)合物，9個(gè)DEGs中有4個(gè)表達(dá)下調(diào)，這4個(gè)下調(diào)的DEGs的轉(zhuǎn)錄水平(即FPKM值)均高于F-NA中的其他DEGs，表明這4個(gè)基因在植物中起著關(guān)鍵作用，冬季葉片組織試圖通過減少光收集復(fù)合物來降低對(duì)光能的吸收。

試驗(yàn)I中葉綠素(a+b)含量從10月26日至1月20日(圖5a)降低了30%（圖5a），試驗(yàn)II和III在0-56天處理后分別降低了23%和15%（圖5b）。這表明，隨著溫度的降低，葉片試圖通過降低葉綠素含量來降低光吸收。試驗(yàn)I中，葉綠素a/b在10月26日至1月20日下降了15%(圖5c)；試驗(yàn)II和III中，從0-56天分別減少8%和6%(圖5d)。葉綠素a/b的變化表明試驗(yàn)I反應(yīng)中心的降解比試驗(yàn)II和III更嚴(yán)重。代表光系統(tǒng)II反應(yīng)中心開放度的光化學(xué)猝滅(qP)在10月26日至1月20日，降低了57%(圖5e)，試驗(yàn)II和III處理0~56天后，qP分別降低了43%和25%(圖5f)。葉綠素(a+b)、葉綠素a/b和qP在試驗(yàn)I中下降得更多，說明光保護(hù)或光抑制作用更明顯。

在KO00195光合作用通路中，DEGs被注釋為負(fù)責(zé)電子傳遞、光系統(tǒng)I或II亞基以及ATP酶等活性蛋白。在KO04146過氧化物酶體通路中，8個(gè)被注釋為超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的DEGs表達(dá)上調(diào)。這兩種途徑中大部分DEGs的轉(zhuǎn)錄水平較低。

此外，除KEGG通路中富集的DEGs外，還有3個(gè)編碼早期光誘導(dǎo)蛋白(ELIPs)的DEGs。ELIPs在試驗(yàn)I中被高度誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)上調(diào)的幅度比試驗(yàn)II和III中要高。ELIPs定位于類囊體膜，它們結(jié)合葉綠素a并在光保護(hù)中發(fā)揮重要作用。它們的積累可以被各種生理?xiàng)l件觸發(fā)，包括光脅迫和低溫，并與光系統(tǒng)II反應(yīng)中心降解相關(guān)。試驗(yàn)I中ELIPs的表達(dá)顯著上調(diào)，說明F-CA中光保護(hù)或光抑制作用更明顯。

4、在F-CA和A-CA中普遍富集的KEGG通路

（1）碳水化合物的新陳代謝。屬于碳水化合物代謝的5個(gè)KEGG通路在三個(gè)試驗(yàn)中都有富集（圖2c和圖6a）。

KO00053抗壞血酸和aldarate代謝、KO01200碳代謝、KO00630乙醛酸和二羧酸代謝途徑中，大部分DEGs在試驗(yàn)I中表達(dá)上調(diào)，而在試驗(yàn)II和試驗(yàn)III中表達(dá)下調(diào)(圖6a)。在KO00040戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑中，試驗(yàn)I的23個(gè)DEGs中有10個(gè)上調(diào)，試驗(yàn)II的17個(gè)DEGs中只有2個(gè)上調(diào)，試驗(yàn)III的25個(gè)DEGs中有3個(gè)上調(diào)(圖6a)。在KO00500淀粉和蔗糖代謝中，試驗(yàn)I的32個(gè)DEGs中有14個(gè)上調(diào)，試驗(yàn)II的21個(gè)DEGs中有9個(gè)上調(diào)，試驗(yàn)III的33個(gè)DEGs中有10個(gè)上調(diào)(圖6a)。KO01200碳代謝圖（未展示）顯示，試驗(yàn)I中磷酸戊糖途徑的所有DEGs和糖酵解過程中的大部分DEGs均上調(diào)，但在試驗(yàn)II和試驗(yàn)III中均下調(diào)。磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑屬于呼吸途徑，在碳水化合物代謝中起重要作用。這些數(shù)據(jù)表明，試驗(yàn)I的碳水化合物代謝變化與試驗(yàn)II和III不同，這可以通過糖含量的變化來證明(圖6b)。

試驗(yàn)I中，10月26日至1月20日，葉片葡萄糖和果糖濃度分別增加了10倍和7倍(圖6b)。然而，試驗(yàn)II和III中，從0-56天處理，葡萄糖和果糖分別僅增加了~1.6倍和2.7倍(圖6b)。試驗(yàn)I在10月26日至1月20日期間葉片蔗糖濃度增加了1.3倍，試驗(yàn)II和III在0~56天期間分別增加了1.2倍和1.3倍(圖6b)。這些結(jié)果表明，葡萄糖和果糖在抗凍性中比蔗糖更重要。

（2）花青素生物合成。KO00941類黃酮生物合成途徑在試驗(yàn)I、II和III中富集的DEGs分別為8、8和11個(gè)，這些DEGs也參與了花青素的生物合成。試驗(yàn)I中8個(gè)DEGs均上調(diào)，試驗(yàn)II和III中分別有1個(gè)和3個(gè)DEGs表達(dá)下調(diào)（圖6c）。除FLS1、HCT和CHS4外，F(xiàn)-NA和A-NA中其他DEGs的FPKMs均低于低溫馴化樣品(即F-CA、A-CA和A-CA+UVB；圖6c)。雖然花青素在A-CA中沒有顯著積累(圖1e)，但C4H、FLS2、DFR、ANS、F3H、ANR、CHS1、CHS2和CHS3的轉(zhuǎn)錄水平(圖6c)高于A-CA+UVB或F-CA，說明低溫可以誘導(dǎo)花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，而花青素生物合成可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的過程。

花青素在細(xì)胞質(zhì)中合成，然后通過谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)轉(zhuǎn)移到液泡中，GST催化花青素與谷胱甘肽結(jié)合。在本研究中，KO00480谷胱甘肽代謝途徑在試驗(yàn)I和III中富集并伴隨花青素積累(圖1e，2c)。在試驗(yàn)I和III中，分別有18和19個(gè)DEGs，其中分別有12個(gè)（都表達(dá)上調(diào)）和13個(gè)（其中8個(gè)表達(dá)上調(diào)）被注釋為GST。說明在花青素合成后谷胱甘肽代謝是一個(gè)重要的途徑。

（3）KO04712植物晝夜節(jié)律通路。該通路在試驗(yàn)I、II和III中分別富集了8、6和8個(gè)DEGs，除了試驗(yàn)III中的一個(gè)下調(diào)外，其余都上調(diào)。COP1-like、HY5和LHY的差異表達(dá)只存在于試驗(yàn)I中（圖6d）。COP1在F-NA和A-NA中呈現(xiàn)不同的初始轉(zhuǎn)錄水平，并在試驗(yàn)I、II和III中上調(diào)(圖6d)。COP1轉(zhuǎn)錄后影響HY5表達(dá)。HY5是堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)家族的轉(zhuǎn)錄因子，是多個(gè)光感受器的下游，該基因在轉(zhuǎn)錄上受光照或低溫的影響。HY5在試驗(yàn)I中表達(dá)量顯著上調(diào)，而4℃處理后，在試驗(yàn)II和III中沒有顯著變化(圖6d)，表明HY5的調(diào)控可能比以前報(bào)道的更復(fù)雜。LHY是MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，被歸類為生物鐘的晨起基因。在本研究中，LHY在F-NA和A-NA中的初始表達(dá)水平顯著不同，試驗(yàn)I中該基因表達(dá)上調(diào)，而在試驗(yàn)II和III中表達(dá)差異不顯著(圖6d)。其他的DEGs被注釋為偽響應(yīng)調(diào)節(jié)器(PRR)/類雙組分響應(yīng)調(diào)節(jié)器或低溫相關(guān)查爾酮合成酶(CHS)，普遍存在于試驗(yàn)I、II和III中(圖6d)。PRR與LHY在生物鐘中被歸為晨起基因，LHY的表達(dá)增強(qiáng)了PRR的表達(dá)。試驗(yàn)II中晝夜節(jié)律通路的DEGs表明，低溫本身干擾了植物的晝夜節(jié)律。

?結(jié)論

研究者通過3個(gè)試驗(yàn)來表征越冬常綠葉片低溫馴化的特征，并發(fā)現(xiàn)低溫前的光信號(hào)對(duì)于進(jìn)一步增加耐凍性至關(guān)重要，因?yàn)槟承┬盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可能會(huì)導(dǎo)致生長停止和低溫馴化。玉米黃質(zhì)的積累是ABA生物合成的上游環(huán)節(jié)，可能在ABA水平中起關(guān)鍵作用。在本報(bào)告中，與營養(yǎng)生長的植物相比，ElsieLee的ABA可能在早秋通過對(duì)光信號(hào)的響應(yīng)而積累，在冬季到來時(shí)下降。光信號(hào)和低溫均擾亂了ElsieLee的晝夜節(jié)律，轉(zhuǎn)錄因子HY5和LHY均參與其中。此外，F(xiàn)-CA和A-CA在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光抑制/光保護(hù)程度、脂肪酸代謝和呼吸等方面的過程也有很大的不同，導(dǎo)致完成低溫馴化或未完成低溫馴化時(shí)的耐凍性不一致。UVB處理A-CAs表明，花青素在常綠葉片低溫馴化過程中與光保護(hù)的相關(guān)性大于增加耐凍性的相關(guān)性。