中文題目：SDG（開環(huán)異落葉松脂素）的次生代謝物途徑觸發(fā)活性氧清除系統(tǒng)來響應(yīng)棉花 Ca 2+脅迫

英文題目：Secondary metabolite pathway of SDG(secoisolariciresinol) was observed to trigger ROS scavenging system in response to Ca stress in cotton.

背景與內(nèi)容

鈣是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)素，它不僅在植物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，而且作為第二信使介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然人們對Ca2+在緩解植物各種生物和非生物脅迫中的作用及其調(diào)控機制進行了深入的研究，但棉花適應(yīng)高Ca2+脅迫的分子機制仍不清楚。我國棉花種質(zhì)資源豐富，分布廣泛，但我國種植的主要棉花種質(zhì)均不耐鈣。因此，從耐鈣品種中挖掘相關(guān)的耐鈣基因，揭示耐鈣機制，對于培育高產(chǎn)耐鈣材料具有重要意義。

本研究對103份棉花材料在200mMCaCl2脅迫下萌發(fā)，從103份棉花材料中篩選出一個極端抗Ca2+基因型（中9807，R）和一個Ca2+敏感基因型（CRI50，S）。然后將這兩份材料分別在0mMCaCl2和200mMCaCl2中發(fā)芽5天，然后取樣進行轉(zhuǎn)錄組測序。形態(tài)學(xué)和生理學(xué)分析表明，在R中特異表達(dá)的PLR2可能通過促進SDG的合成來增強棉花清除活性氧的能力。綜上所述，本研究提出了棉花應(yīng)對高鈣脅迫的適應(yīng)機制，有助于提高棉花的抗逆性。

實驗材料與方法

1、CaCl2濃度篩選

在103份棉花材料的子葉期用不同濃度的CaCl（20mM、100mM、200mM、300mM、400mM和500mM）處理耐鹽棉花材料zhong9807，以0mMCaCl2處理為對照。

2、棉花材料

在本研究中，四個棉花品種的103份棉花材料在萌發(fā)期間受到200mMCaCl2脅迫。根據(jù)發(fā)芽情況，分別選擇了1份耐CaCl2脅迫的棉花品種（zhong9807，R）和1份對CaCl2脅迫敏感的品種（CRI50，S）。

3、轉(zhuǎn)錄組測序

用0mMCaCl2和200mMCaCl2脅迫棉籽發(fā)芽。將種子置于25℃的人工培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)5天，收集萌發(fā)期的全株樣品，每個樣品重復(fù)三次。所有單個樣品放于?80?，用于生理測量和轉(zhuǎn)錄組分析。轉(zhuǎn)錄組分組情況：高抗性棉花（zhong9807，R）對照組RCK與實驗組RCa；敏感棉花（CRI50，S）對照組SCK和實驗組SCa。

4、qRTPCR分析

從CaCl2脅迫處理后的zhong9807（R）和CRI50（S）轉(zhuǎn)錄組中，隨機選擇20個差異基因進行qRTPCR驗證，最后分析qRT-PCR與RNA-seq的相關(guān)性。

結(jié)果與討論

1、ABA信號與Ca2+信號聯(lián)合緩解棉花高Ca2+脅迫

植物在受到非生物脅迫時，其細(xì)胞中的ABA會顯著增加，細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+也會顯著增加，最后表皮細(xì)胞氣孔關(guān)閉和核轉(zhuǎn)錄反應(yīng)伴隨信號傳遞發(fā)生。在本研究結(jié)果中，高Ca2+脅迫后，2個編碼鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白（CBL）的基因、8個編碼CBL相互作用蛋白激酶（CIPK）的基因和4個編碼鈣依賴性蛋白激酶（CDPK）的基因的表達(dá)水增加。CBL、CIPK和CDPK是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因，可感知與ABA相關(guān)的Ca2+濃度增加。CDPKs或CBL/CIPKs結(jié)合復(fù)合物隨后特異性調(diào)節(jié)下游靶點，包括ABA反應(yīng)元件（ABRE）和ABRE結(jié)合因子（ABF）。在R和S上調(diào)的基因中，分別鑒定了10個和百邁客生物科技8個編碼ABA反應(yīng)元件結(jié)合因子的基因。大多數(shù)基因編碼相同的元件，如ABF2、ABI5、DPBF2，但R的ABF3和DPBF3基因比S的多。研究表明，ABF2和ABF3不僅由ABA誘導(dǎo)，而且還由滲透脅迫（如高鹽濃度和脫水）誘導(dǎo)。同時，DPBF3可以與ADF5的啟動子結(jié)合，ADF5的轉(zhuǎn)錄被ABA反應(yīng)元件激活。因此，在高Ca2+脅迫下，R的萎蔫程度比S輕，部分原因可能是ABA信號控制表皮細(xì)胞的氣孔關(guān)閉，減少水分損失，使植物保持直立。

2、通道蛋白參與離子和水平衡調(diào)節(jié)

通道蛋白AQPs可以形成一個促進水運輸所需的水特異性通道，從而提高了植物在各種非生物脅迫下的適應(yīng)性。差異基因富集分析發(fā)現(xiàn)，R組中18個上調(diào)的DGEs在通道活性途徑（GO:0015267）顯著富集，其中16個基因編碼水通道蛋白（AQP），在S組中，13個上調(diào)的DGEs在通道活性途徑（GO:0015267）顯著富集，12個基因編碼AQP?；谇捌谘芯?，作者假設(shè)PIP2–2緩解了Ca2+脅迫，可能是因為細(xì)胞表皮上的水通道可以吸收細(xì)胞間隙的水分，這有利于維持棉花的原始含水量。如果細(xì)胞內(nèi)的水也可以通過PIP2–2從細(xì)胞內(nèi)輸送到細(xì)胞外，這可能是棉花R中Ca2+脅迫耐受的主要原因。在高Ca2+脅迫下，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度增加時，PIP2–8將鈉或鉀運輸出細(xì)胞，并有助于維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡。因此，本研究推測PIP2–8和PIP2–2對植物耐高Ca2+脅迫的作用相同，它們都可以通過緩解滲透脅迫來提高棉花對高Ca2+脅迫的耐受性。同時，作者還發(fā)現(xiàn)，高Ca2+脅迫后，R和S的shaker型K通道基因（SKOR）的表達(dá)水平上調(diào)，但該基因在S中的表達(dá)高于在R中的表達(dá)，推測SKOR編碼的鉀通道可能不是緩解R中高Ca2+脅迫的關(guān)鍵途徑。

3、高Ca2+脅迫下的Ca2+信號主要由CML蛋白介導(dǎo)

在非生物脅迫下，不同的Ca2+調(diào)節(jié)蛋白會對不同的脅迫作出反應(yīng)。在本研究中，高Ca2+脅迫下，Ca2+信號主要由CMLs、CBLs和CPKsCa2+感受器介導(dǎo)。此外，在R組上調(diào)的基因中，編碼這三種類型的基因分別為9、2和4個，其中編碼CML的基因數(shù)量最多。編碼CML的9個基因編碼不同類型的CML，其中CML10、CML21和CML22為R特異性表達(dá)，CML8和CML41為S特異性表達(dá)。然而，在轉(zhuǎn)錄組R和S中的DEGs中沒有CaM相關(guān)基因。因此，我們推測CML是應(yīng)對高Ca2+應(yīng)激的主要Ca2+感受器。結(jié)果表明，在高Ca2+脅迫下，R可以通過提高CML的活性來清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，從而提高棉花對高Ca2+脅迫的耐受性。

4、SDG的合成增強了棉花清除活性氧的功能

高Ca2+處理后，R組中存在一個特殊的KEGG途徑，即生物合成各種次級代謝產(chǎn)物-第2部分（KEGG:ko00998），它可以合成SDG，而SDG是植物中具有抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物，其在植物中的抗性機制尚不清楚。之前研究表明PLR1參與SDG的合成，且其啟動子與ABA轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，ABA可以通過PLR1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控促進SDG的合成和積累。在高Ca2+脅迫后，PLR2（GH\UA08G1771）在R中特異性表達(dá)，在S中未檢測到PLR2表達(dá)的變化，這表明只有PLR2對R中的高Ca2+脅迫有反應(yīng)。因此，推測PLR2可能合成具有類似PLR1抗氧化特性的SDG。綜上所述，PLR2可以調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞功能相關(guān)的下游基因，共同提高高Ca2+脅迫下棉花清除活性氧的能力，從而增強棉花對高Ca2+脅迫的抗性。

5、高抗性棉花R緩解高Ca2+脅迫的分子機制

當(dāng)Ca2+從細(xì)胞外或液泡涌入細(xì)胞質(zhì)時，細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度會增加，Ca2+會與一些Ca2+受體蛋白CaM和CML結(jié)合，形成Ca2+/CaM（CML）結(jié)合蛋白。激活的Ca2+信號導(dǎo)致一些下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)增加，如WRKY和bZIP，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水和離子的平衡，細(xì)胞在傳遞Ca2+信號后可以迅速恢復(fù)到低濃度Ca2+環(huán)境的狀態(tài)。同時，一些激素也受Ca2+信號的調(diào)節(jié)，如ABA和SA，可以緩解棉花中的Ca2+瞬變。當(dāng)植物暴露于高濃度的Ca2+時，它們再也不能抵抗單獨由通道蛋白引起的大量Ca2+造成的損害。R將通過ROS清除機制與通道蛋白形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，共同緩解高Ca2+應(yīng)激。滲透受體感應(yīng)到Ca2+的增加，然后調(diào)節(jié)ABA的合成，激活A(yù)BA信號通路。首先，增加的ABA與PYL蛋白結(jié)合并與PP2C相互作用，通過SnRK促進一些下游因子的磷酸化，并啟動ABA信號反應(yīng)。此時，編碼PLR2的轉(zhuǎn)錄因子ABRE和MYB被激活。然后，通過促進松脂醇合成落葉松烯醇，落葉松烯醇合成SDG，從而提高活性氧的清除能力，從而增強棉花抵御高Ca2+脅迫的能力（圖4）。

結(jié)論

本文主要探討不同棉花材料在高鈣脅迫下的不同耐性機制?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和以往對非生物脅迫下各種機制的研究，推測棉花在高Ca2+脅迫下仍然通過Ca2+信號通路傳遞和激活各種信號。在高Ca2+脅迫后，與通道活性和抗氧化活性相關(guān)的基因可能占據(jù)相對較大的比例。通道蛋白通過平衡細(xì)胞內(nèi)外的水和陰離子來緩解高鈣脅迫下的滲透脅迫。同時，在Ca2+和ABA的相互作用下，棉花還通過促進SDG的生成來減輕氧化應(yīng)激，從而減少ROS在棉花中的積累。棉花耐高濃度Ca2+的分子機制將有助于促進高Ca2+地區(qū)植物的生長發(fā)育，為西部喀斯特地貌區(qū)植被恢復(fù)和荒漠化防治提供重要幫助。