ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析，可以獲得ATAC檢測到的染色質高度可及性區(qū)域與對應轉錄本表達的相關性，以及對應轉錄本相關基因的上游調控序列，構建TF結合后的基因表達調控機制，從而整體分析該特定時空下從DNA到RNA的調控網絡，并且相互驗證，進一步結合基因功能分析、實驗表型進行討論，清晰展現(xiàn)從表觀調控——基因表達——基因功能——表型的生物學過程。百邁客擁有完善的ATAC-seq與轉錄組聯(lián)合分析流程，云平臺配套專業(yè)豐富的分析工具，輕松滿足您的個性化分析需求！接下來，小編以一篇文獻為例帶領大家深刻認識ATAC-seq與轉錄組聯(lián)合分析方案。

文章信息

中文標題：ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析揭示了斜帶石斑魚性逆轉過程中染色質的可及性

英文標題：Integration of ATAC-seq and RNA-seq Unravels Chromatin Accessibility during SexReversal in Orange-Spotted Grouper (Epinephelus coioides)

影響因子：6.208

期刊：International Journal of Molecular Sciences

研究目的

采用ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析斜帶石斑魚（雌雄同體）性腺在性逆轉過程中的開放染色質區(qū)域和TF結合位點，以探究斜帶石斑魚性逆轉的分子機制。

研究亮點

• ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)合分析構建TFs及其靶基因的復雜網絡、探索性逆轉過程的潛在機制。
• 整體分析斜帶石斑魚性逆轉過程中從DNA到RNA的調控網絡，為斜帶石斑魚的基因組分析以及其他表觀遺傳學信息分析奠定基礎資料。
• ATAC-seq+RNA-seq+實驗驗證，清晰展現(xiàn)從表觀調控-基因表達-基因功能-表型的生物學過程。

研究背景

石斑魚（Epinephelus）是雌雄同體的魚類，在其生活史中經歷了從雌性到雄性的性別變化，是研究性別分化和性別逆轉的良好模型。斜帶石斑魚是亞洲重要的經濟石斑魚物種，其在自然條件下，于大約4-5齡時會改變性別。然而，斜帶石斑魚的性逆轉的分子機制仍不清楚。以往的研究表明，許多轉錄因子，如sox（性別決定區(qū)Y-box）、wnt（無翅基因/整合基因）、dmrt（dsx和mab-3相關轉錄因子）和nanos，在性逆轉過程中發(fā)揮著重要作用。然而，對性逆轉過程中的轉錄變化仍缺乏全面的了解。

染色質結構在維持基因表達的調控中起著關鍵作用，可接近的染色質區(qū)域是轉錄因子（TFs）和順式元件的結合位點。因此，來自這些開放區(qū)域的信息將增強我們對TF結合、染色質狀態(tài)和基因表達調控之間關系的理解。ATAC-seq是2013年開發(fā)的一種新方法，已在許多研究中廣泛應用于檢測開放染色質區(qū)域。該文首次在斜帶石斑魚性逆轉期間使用ATAC-seq對性腺的原始細胞核進行檢測，揭示不同發(fā)育階段染色質可及性的差異，以便從一個新的角度探索性逆轉的機制。作者采用ATAC-seq與RNA-seq聯(lián)合分析，以確定性逆轉過程中幾個途徑中的TFs網絡和核心基因。此外，在這一過程中還發(fā)現(xiàn)了一組與性別相關的基因。

研究方法

材料：斜帶石斑魚（體重1.90±0.65kg，體長43.75±9.25cm）分為兩組，對照組（n=25）和MT植入組（10mg/kg;n=25）（廣東大亞灣漁業(yè)發(fā)展中心），水池養(yǎng)殖（T：22.7–27.8?C）。

實驗方法：MT誘導的性逆轉：在植入前（第0周），隨機獲得5條魚的性腺以確定發(fā)育階段。MT植入后，每周分別從兩組中隨機抽取5條魚的性腺組織（每條魚的性腺切成三部分），實驗進行5周。性腺的增殖檢測：免疫組織化學IHC分析；胞凋亡的檢測：TUNEL分析；組織定量表達：RT-qPCR；基因定位：原位雜交ISH。

測序策略：ATAC+轉錄組

研究結果與分析

一、斜帶石斑魚的人工性別逆轉以及性逆轉過程中性腺的增殖檢測和胞凋亡的檢測

MT處理前，石斑魚仍處于初級生長卵母細胞（PO）和皮質肺泡期卵母細胞（PVO）豐富的階段（圖1a）。在整個實驗過程中，對照組石斑魚的性腺也保持在同一階段（圖1b、d、f）。相反，MT植入組的石斑魚從雌性變?yōu)樾坌?。在組織學上，MT植入后一周，性腺中的卵母細胞退化，新的生精囊腫增生，這被定義為性逆轉的早期階段（第1周；圖1c）。植入后三周，性腺進入性逆轉中期，其特征是大量精原細胞（SG）和精母細胞（SCs）以及數(shù)量有限的卵母細胞（第3周；圖1e）。植入后5周，性腺進入性逆轉后期，擁有大部分雄性生殖細胞，與自然睪丸相似（第5周；圖1g）。

為了研究MT誘導的性逆轉過程中性腺中的增殖信號，采用免疫組織化學（IHC）檢測增殖細胞核抗原（PCNA）的表達。在對照組中，PCNA信號主要位于體細胞中（圖2a）。在性逆轉早期，在新發(fā)育的雄性生殖細胞中觀察到PCNA陽性信號（圖2b）。在性逆轉中期，PCNA信號主要在男性生殖細胞中檢測到（圖2c）。在性逆轉后期，僅在SG和SC中觀察到信號（圖2d）。此外，作者采用TdT介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）來檢測卵母細胞的凋亡情況。結果表明，在正常卵巢中很難檢測到TUNEL信號（圖3a）。在性逆轉的早期，在一些卵母細胞和體細胞中可以發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性信號（圖3b）。在性逆轉中期，TUNEL陽性信號更強，僅在卵母細胞中觀察到（圖3c）。在性逆轉后期，信號出現(xiàn)在幾個細胞中，這些細胞可能是體細胞或假陽性信號（圖3d）。以上結果表明斜帶石斑魚在人工性別逆轉過程中，卵母細胞發(fā)生凋亡，而雄性生殖細胞則出現(xiàn)增殖。

圖1+2+3人工性別逆轉以及性腺的增殖檢測和胞凋亡的檢測注：PO：初級生長期卵母細胞；PVO：皮質肺泡期卵母細胞；SG：精原細胞；SC：精母細胞；ST：精細胞。

二、ATAC-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)結果概述

作者聯(lián)合ATAC-seq和RNA-seq研究斜帶石斑魚在性逆轉過程中可獲得的染色質、基因表達譜以及它們之間的關系。斜帶石斑魚性腺組織被分為三組：MT植入一周（中間組I）、MT植入后五周（睪丸組T）和未植入MT（對照組C）。ATAC-seq數(shù)據(jù)顯示平均比對率為73.34%，每個樣品有12.7百萬個合格片段（圖4b）。所有文庫片段長度都如預期所示，包括大多數(shù)小片段（<200bp，為核小體間開放染色質）和逐漸減少的大片段(≥200bp，系跨越核小體的開放染色質)（圖4c）。在ATAC-seq檢測到的假定易接近區(qū)域中，超過50%位于轉錄起始點（TSS）上游2kb處，尤其是TSS上游1kb處的啟動子，約32%位于遠端基因間區(qū)域，其余18%位于基因體的內含子、外顯子和基因下游（圖4d）。此外，確定的可接近區(qū)域大多富集在TSS的2kb范圍內（圖4e），這與斜帶石斑魚這些區(qū)域中存在順式調控元件（啟動子、增強子、沉默子等）相一致。

研究發(fā)現(xiàn)ATAC-seq峰在幾個性別相關基因附近高度富集。hsd17b7（羥基類固醇（17β）脫氫酶7）附近的峰值在睪丸組中顯著富集，但在對照組和中間性組中未檢測到（圖5a）。ATAC分析發(fā)現(xiàn)在三個發(fā)育階段的性腺中檢測到4552個共同峰和無數(shù)特有的峰（圖5b）。轉錄組分析顯示在六個樣本中檢測到534個共有基因（圖5c），組間比較結果顯示：與中間性組相比，對照組中有1291個上調基因和7個下調基因；與睪丸組相比，對照組共檢測到2888個上調基因和326個下調基因；與中間性組相比，睪丸組有984個上調基因和843個下調基因（圖5d）。

三、差異可及區(qū)域中高度富集的已知基序及其靶基因

為了確定染色質可及性差異的潛在驅動因素，作者篩選出差異可及區(qū)域與組成性開放區(qū)域相比的前十個上調TF基序的富集情況，并列出了對照組與中間性組中前十個基序的富集和DNA序列（圖6a）。其中，*豐富的基序是ZNF263（鋅指蛋白263）、SPIB（轉錄因子）和RFX4（調節(jié)因子×4）。在可接近染色質區(qū)域聚集的ZNF263全位點附近檢測到TF占用的相對清晰的足跡（圖6b）。ZNF263與基本細胞過程相關，很少有研究確定ZNF263在生殖方面的作用。該研究結果表明，ZNF263在性逆轉過程中調用了大量的性相關基因，暗示ZNF263可能通過對其靶基因的轉錄調控在性逆轉中發(fā)揮重要作用。在*豐富基序的目標基因中，許多基因與性逆轉相關，形成TF基因網絡。研究發(fā)現(xiàn)許多TF結合基因參與細胞增殖、細胞分化和類固醇合成，包括zbtb16、dmrt1、sox11、star（類固醇生成急性調節(jié)蛋白）和hsd17b7。為了說明潛在的調控網絡，作者在對照組和中間性組的比較中繪制了ZNF263、SPIB、ETV2及其靶基因的網絡圖（圖6c）。

四、性別相關差異表達基因（DEG）的表達水平

研究發(fā)現(xiàn)已知的TFs基序以高度性別優(yōu)先的方式富集（圖7）。氣泡圖顯示了與性逆轉相關的30個DEG的富集和表達情況，這30個DEG對性腺發(fā)育和性調節(jié)至關重要，包括bmp15、cyp19a1、daz（l刪除活力缺乏精子）、dnd、dmrt1-3、foxl2、nanos2-3、piwil1和sox9。此外，基序出現(xiàn)的時間與相應基因的表達一致。例如，MT植入5周后，dazl和dmrt2及他們結合的基序在性腺中強烈富集。研究還發(fā)現(xiàn)dnd、nanog、nanos3和SAL4在卵巢和雌性偏好的中間性腺中顯著性表達，而dmrt1、gas8、piwil1和star的表達水平在睪丸中顯著。

五、RT-qPCR驗證數(shù)據(jù)推斷的DEG

在30個DEG中，對12個基因進行RT-qPCR，以驗證轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性，并分析性別逆轉期間基因的表達模式。結果表明，這些基因的表達模式與轉錄組數(shù)據(jù)基本一致。卵巢中bmp15、dnd、gdf9和nanog的表達顯著高于睪丸，并且在性逆轉期間其表達逐漸降低（圖8a、d、e、g）。睪丸中dmrt1、nr5a2、star（類固醇生成急性調節(jié)蛋白）、sox9（性別決定區(qū)Y-box9）和rergl（ras相關和雌激素調節(jié)生長抑制物樣基因）的表達顯著高于卵巢，尤其是MT植入后五周的性腺（圖8b、f、j、k、l）。

六、性相關基因的定位

用原位雜交（ISH）技術分析了不同性腺階段性相關基因（dazl、Dmrt1、star、rergl）的定位。dazlmRNA僅限于斜帶石斑魚的雌性和雄性生殖細胞（卵母細胞、SG和SC）表達（圖9a、b），結果表明dazl是一種生殖細胞標記物，在睪丸中高表達，這與其他物種中dazl的表達一致。在自然雌性的卵巢中未檢測到Dmrt1信號（圖9d）。性逆轉后期的性腺有豐富的雄性生殖細胞SG、SC和ST，帶有dmrt1陽性信號，而卵母細胞沒有dmrt1信號（圖9e），因此dmrt1可以被認為是斜帶石斑魚的生殖細胞標記。star作為合成類固醇激素途徑中的限速酶，其在雄性斜帶石斑魚的睪丸中特異表達，而在卵母細胞中未檢測到star信號（圖9g）。此外，發(fā)現(xiàn)starmRNA在SG、SC和ST中表達（圖9h）。rerglmRNA僅在雄性生殖細胞中檢測到（圖9j，k），這與RT-qPCR結果一致，暗示其在性別調節(jié)中的潛在作用。dazl、dmrt1、star和rergl的雜交探針作為對照實驗顯示性腺中沒有信號（圖9c、f、I、l）。

七、根據(jù)性逆轉早期的RNA序列推斷ATAC-seq的核心峰

分析ATAC-seq和RNA-seq的相關性，以探索轉錄活性的變化，并捕獲性逆轉早期的關鍵轉錄因子。圖10a列出了前20個KEGG富集途徑，如賴氨酸降解途徑、肌動蛋白細胞骨架調節(jié)途徑等。在雌激素信號通路中，對照組與中間性組相比有17個DEG，比如gnas、grb2、esr2（雌激素受體β）等。在這些基因中，我們在ATAC-seq的相同比較結果中只發(fā)現(xiàn)了gnas的峰值，它位于通路的上游。gnas的峰值由ZNF263調節(jié)，這表明gnas染色質的變化可能是觸發(fā)該通路中下游基因差異表達的核心基因。在卵母細胞減數(shù)分裂途徑中檢測到13個DEGs，包括PKA、SMC1和PGR等，然而，在ATAC-seq數(shù)據(jù)中僅發(fā)現(xiàn)ccnb2峰。在人工性逆轉過程中，參與類固醇激素生物合成的幾種酶，如HSD17B1和CYP19A發(fā)生了顯著變化。除CYP21A外，大多數(shù)DEG的表達均低于對照組（圖10b）。CYP21A是將類固醇轉化為皮質醇的關鍵酶，據(jù)報道，?？~的皮質醇在性轉變期間表達達到峰值，這表明皮質醇在性逆轉中起作用。然而，本研究結果表明雌激素和雄激素的合成受到抑制，而在人工誘導的性逆轉過程中，腎上腺皮質酮的合成上調，這為斜帶石斑魚的性逆轉提供了新的見解。

總結

該研究首次采用高靈敏度的ATAC-seq方法對性逆轉期間的斜帶石斑魚進行了開放性染色質分析。這項技術可以定位潛在的基因調控區(qū)域。通過ATAC-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，我們確定了許多不同發(fā)育階的新的性別相關基因。對ATAC-seq鑒定的開放染色質區(qū)域的進一步挖掘揭示了重要TFs與下游基因的網絡，以及染色質可及性的變化，這些變化可能在性逆轉中起重要作用。本研究為今后的研究提供了重要的數(shù)據(jù)集和多種新的研究途徑。

參看文獻：

XiWu,YangYangandChaoyueZhongetal.,IntegrationofATAC-seqandRNA-seqUnravelsChromatinAccessibilityduringSexReversalinOrange-SpottedGrouper(Epinepheluscoioides)[J].Internationaljournalofmolecularsciences,2020,21(8):2800