1、前言

1.1 適用范圍

本指南介紹百邁客實驗平臺空間轉錄組產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細閱讀。

1.2 聲明

我國法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風疹、麻風病、急性出血性結膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。涉及上述傳染病的科學研究需符合國家的相關規(guī)定，為嚴格遵守國家法律法規(guī)，本著對社會及相關操作人員負責的態(tài)度，我司要求客戶方真實準確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進行事先說明。樣品中含有上述感染性病原體時，客戶方需要提供符合生物安全等級要求的實驗室以便開展相關實驗，實驗進行時，客戶方有義務協(xié)助我方實驗員做好實驗安全防護?？蛻舴讲坏秒[瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進行相關項目，已產(chǎn)生的費用由客戶方承擔。如因客戶方提供的生物安全性信息不實、隱瞞樣品感染性等有關情況等造成實驗員及相關人員被感染、疾病傳播等嚴重后果的，我司將按規(guī)定報告國家相關部門，并將通過法律等手段追究相關責任。

2、項目流程

目前百邁客空間轉錄組測序服務模式默認為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門服務，請與百邁客技術人員確認實驗室儀器設備情況。組織寄送前請至少提前 1 周進行預約，百邁客接收到樣本并確認樣本無異常后，3-5 天內(nèi)安排 RNA 質檢并反饋質檢結果，質檢合格后安排切片、組織結構確認與透化。

3、新鮮冷凍樣本

3.1 樣本要求

10x 空間轉錄組每塊組織樣本長寬不宜超過 6.5*6.5mm2，百創(chuàng) S1000 空間轉錄組每塊組織樣本長寬不宜超過 6.8*6.8mm2，厚度＞1.5mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個包埋成一個 OCT 包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面充分利用捕獲區(qū)域。

注 1：在樣本量足夠的情況下，每個動物樣本最好準備至少 2 個包埋塊，1份用于 RNA 質檢（切片質控標準見第 3.3 部分）、切片選片、上透化芯片和表達芯片，另 1 份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

注 2：在樣本量足夠的情況下，每個植物樣本最好準備至少 3-5 個包埋塊，因植物組織目的結構較薄，RNA 質檢（切片質控標準見第 3.3 部分）、切片選片、上透化芯片和表達芯片，需各準備一個包埋塊。避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

3.2 樣本采集與運輸

3.2.1 采集前準備

1) 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預冷；

2) 在醫(yī)用托盤上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無菌布，將個體放在無菌布上進行取樣，保持整個取樣過程在低溫中進行，可以延緩核酸的降解，（動物組織建議針對活體或剛死亡個體進行解剖取樣）；

3) 動物組織如果取樣后無法立即進行后續(xù)包埋實驗，可以將樣本清理干凈后，暫時放入組織保護液（美天旎，貨號130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時間最長不要超過5h，以免造成RNA降解，RIN值質檢不合格；

4) 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）進行包埋，OCT使用前在冰上預冷30分鐘。

3.2.2 動物樣本采集

1) 取下新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈）；

2) 迅速用預冷的 PBS 溶液（RNase free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無菌紗布吸凈表面液體；

3) 如果組織體積較大，需要將組織切成長寬＜6.5*6.5mm2（10x Genomics）/6.8*6.8mm2（百創(chuàng)S1000）的小塊，用7*7*5mm2的特小號包埋盒進行包埋；取下的組織應立即進行后續(xù)包埋實驗。

注：原則上實驗室不提供組織冷凍包埋相關試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運營確認實驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運送，實驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.3 植物樣本采集

1) 在無菌超凈臺中處理組織，從活體植株上取下新鮮目標區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成＜6.5*6.5mm2（10x Genomics）/6.8*6.8mm2（百創(chuàng)S1000）的小塊；

2) 利用預冷的蒸餾水將組織沖洗 3 次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液，用7*7*5mm2的特小號包埋盒立即進行包埋；

注：原則上實驗室不提供組織冷凍包埋相關試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運營確認實驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運送，實驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.4 動物組織速凍包埋

下文提供了 2 種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶可根據(jù)實驗條件進行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護細胞完整性，但操作較復雜，而且異戊烷對人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進行冷凍包埋。

方法 1 干冰包埋法（常用）

無需異戊烷，直接用干冰粒進行包埋。

1) 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；

2) 標記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；

3) 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷 OCT，避免產(chǎn)生氣泡；

4) 冰上預冷鑷子，將組織放入 OCT 中，調(diào)整好方向，用 OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT 冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；

5) 將包含組織和 OCT 的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會影響組織的方向，同時能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。

6)?將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法 2 異戊烷+液氮包埋法

異戊烷液氮不接觸新鮮組織冷凍和 OCT 包埋同時進行。

1) 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 15 分鐘；

2) 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；

3) 標記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；

4) 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷 OCT，避免產(chǎn)生氣泡；

5) 冰上預冷鑷子，將組織放入 OCT 中，調(diào)整好方向，用 OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT 冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；

6) 用鑷子將包埋盒放到異戊烷中，但不要使異戊烷浸入包埋盒內(nèi)，直到組織凍結，冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化；

7) 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運輸。

3.2.5 植物組織速凍包埋

下文提供了 3 種包埋方法，根據(jù)植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：

方法一：固定+抽真空

1) 將植物組織浸泡在 1ml 0.05%吐溫 20 中,室溫 15min

2) 將植物組織浸泡在 1ml 預冷的 EAA（無水乙醇：乙酸 3:1）中，抽真空 10min，固定組織。

3) 將組織轉入新的加入了 1ml 預冷的 10%蔗糖溶液（用 1X PBS 配制）的 EP管中（此時組織漂浮在液面上），抽真空 20min。小心取出 EP 管并蓋緊，注意不要搖晃讓溶液中混入空氣，在 4℃中震蕩至少一個小時，直至組織沉底。

4) 取出 EP 管，去除其中溶液，加入預冷的 20%蔗糖溶液（用 1X PBS 配制），重復操作 3。

5) 按照組織個數(shù)，室溫下，用 OCT 包埋劑填滿包埋盒，注意盡量不要產(chǎn)生氣泡，并在包埋盒上寫上樣品名稱做好標記（可拍照記錄）。

6) 取出 EP 管置于冰上，將放在蔗糖溶液中的組織取出，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液?？紤]到植物組織，如莖桿中的維管束本身就存在空隙，所以盡量不要吸干整個組織中的蔗糖溶液，防止空氣進入。用鑷子輕輕夾住組織，緩慢放入 OCT 包埋劑中，直至 OCT 完全包裹組織，如果有氣泡可以用移液器將氣泡吸出。室溫下靜止 20-30min，使殘留的蔗糖溶液與 OCT 充分融合。

7) 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5- 10 分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結 。

8) 調(diào)整組織在 OCT 中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標平面與切面水平一致。如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用 200 μl 槍頭吸出氣泡。

9) 用鑷子夾住包埋盒置于預冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待 OCT 凝固變白。

10) 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標記，利用干冰運輸。

方法二 ：抽真空+異戊烷冷凍 OCT 包埋（不需要固定）

1) 在無菌超凈臺中處理，從活體植株上取下新鮮目標區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中 ，利用 4℃預冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成 6.5*6.5mm 大小 ，去除植物組織目標區(qū)域之外其余組織，空隙較多組織（花苞、莖尖）將組織部分切開利用預冷的蒸餾水將組織沖洗 3 次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液 。

2) 將植物組織浸泡在 1ml 0.05%吐溫 20 中,室溫 15min。

3) 冰上預冷 75% OCT 包埋劑溶液（7.5mlOCT+2.5ml 滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入 500 μl 75%的 OCT，將植物組織浸潤在其中，將平底的無吸附膜的吸附柱放入 1.5ml 離心管中，以防止抽真空過程組織上浮在 OCT 表面，打開所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空 10min，摸索設置成 V-AQ，促進 OCT 溶液充分包裹和進入組織空隙中，保證 OCT 填充包埋組織的完整性。如下圖：

4) 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5- 10 分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結 。

5) 將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的 OCT 包埋劑，約 1/4 深度 ，微凝固后待用，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

6) 在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的 OCT，緩慢放入預冷的含 OCT的包埋盒中 ，加預冷的 OCT 直至完全包裹組織，并調(diào)整組織在 OCT 中的位置 ，保證目標平面與切面水平一致，如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用 200 μl 槍頭吸出氣泡。

7) 用鑷子夾住包埋盒置于預冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待 OCT 凝固變白。

8) 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標記，利用干冰運輸。

方法三 ：直接冷凍 OCT 包埋（不需要固定 ，不需要抽真空）

1) 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5- 10 分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結 。

2) 將包埋盒（冷凍切片 OCT 包埋盒 ，7x7x5mm，實際尺寸是 10 x 10 x 5mm）放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的冰上預冷的 OCT 包埋劑，約 1/4 深度，微凝固后待用，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

3) 在無菌超凈臺中處理組織，從活體植株上取下新鮮目標區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中 ，利用 4 度預冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成 6.5*6.5mm 大小 ，去除植物組織目標區(qū)域之外其余組織，利用預冷的蒸餾水將組織沖洗 3 次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液 。

4) 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預冷的 OCT 包埋劑中 ，直至 OCT完全包裹組織。

5) 調(diào)整組織在 OCT 中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標平面與切面水平一致。如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用 200 μl 槍頭吸出氣泡。

6) 用鑷子夾住包埋盒置于預冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待 OCT 凝固變白。取出包埋盒并放入-80℃保存（在室溫下，異戊烷溫度會迅速升高，冷凍過程中一旦異戊烷升溫，需要馬上置于液氮中重新冷卻）或直接進行切片。冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化。

7) 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標記，利用干冰運輸。

3.2.6 樣本寄送運輸

包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長期保存，或者放置在干冰上進行冷凍運輸，寄送到百邁客實驗室，干冰寄送推薦用量約 5kg/日。

不規(guī)范送樣示例：

A.包埋時組織放置靠近最下層，組織未被 OCT 包裹，導致樣本 RNA 降解，質檢不合格；

B.組織暴露在空氣中，導致樣本降解，組織兩側無 OCT 支撐，展片時可能會破壞樣本結構；

C.組織較小，不滿足做表達最小 25%的要求；

D.同一個包埋塊包埋了多個樣本，但不在同一個平面，并且每一個樣本組織過小，覆蓋區(qū)域有限，可能導致分析有效數(shù)據(jù)偏低。

3.3 切片質控標準

組織形態(tài)學檢測：對切片進行 H&E 染色，觀察是否獲取到目標區(qū)域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內(nèi)（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。

RNA 完整性檢測：取 10-15 張切片，利用 Agilent2100 對樣本進行 RNA 完整性檢測，要求 RNA RIN≥7，則認為樣本完整性滿足實驗要求，可以進行后續(xù)實驗。具體切片質檢量如下：

1）10 微米切片厚度，組織占包埋塊面積的 1/5-1/4，質檢量要求~15 張（左圖）；

2）10 微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質檢量要求~10 張（右圖）。

3.4 測序數(shù)據(jù)量推薦

測序數(shù)據(jù)量：推薦 60G/樣；

測序平臺：NovaSeq 6000（PE150）。

4、FFPE 樣本

4.1 樣本要求

1）目前 10x Genomics FFPE 空間轉錄組適用物種為人和小鼠，用于 FFPE 樣本的捕獲區(qū)域為 6.5*6.5mm2，若組織塊超過 6.5*6.5mm2，則需要對樣本進行劃割，確定目標區(qū)域為 6.5*6.5mm2內(nèi)；

2）在樣本量足夠的情況下，每個樣本最好準備至少 2 個石蠟塊，1 份用于質控和正式實驗，另 1 份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

4.2 樣本寄送運輸

石蠟包埋好組織塊放在密閉的容器中，4℃寄送，低溫運輸以確保 RNA 的完整性。

4.3 切片質控標準

FFPE 空間實驗啟動前需要從石蠟切片中提取 RNA 進行 DV200 的質檢和在Test 玻片上貼片測試組織的粘附性。當 DV200＞50%且組織粘附性高時，實驗成功率更高，因此若有多余的蠟塊可送備份從而保證實驗的順利進行。

1）提取 RNA 檢測 DV200：要求 DV200≥50%，DV200 檢測表示大于 200 個核苷酸的 RNA 片段占所有 RNA 片段的百分比，指控合格可以表明 RNA 沒有片段化嚴重，降解程度較輕，RNA 完整性較高；

檢測 DV200 樣本量要求：10 微米切片厚度，截面積＞50mm2，~5 張；截面積＜50mm2，~10 張。

2）組織粘附性：石蠟樣本容易脫片，需要在 Test 玻片上貼片測試組織的粘附性，是否脫片，組織粘附性高時，實驗成功率更高。

粘附性樣本量要求：兩個樣本測試一張 Test 芯片（此芯片是 10x 定制的芯片），每個樣本需要 4 張切片。

4.4 測序數(shù)據(jù)量推薦

測序數(shù)據(jù)量：推薦 60G/樣；

測序平臺：NovaSeq 6000（PE150）。